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描述：

初級內體（EE）是次級成熟內體的起點，   初級內體主要是由內吞的囊泡相互融合形成。初級內體不僅僅 通過網格蛋白介導的信號通路接受胞吞物，還有其他許多通路。胞吞機制除了在維持正常細胞生理中起到重 要作用，還在阿爾茲海默病和遺傳性溶酶體儲積癥等許多疾病中發揮了很大作用。傳統分離內體的方法是采 用密度梯度超速離心法，   需要大量起始原材料， 方法繁瑣費時。  Minute TM 內體分離試劑盒基于離心管柱法，  快速簡單，  僅需要少量的培養細胞或者毫克級的組織樣品。   本試劑盒可以從培養的細胞和組織樣品中大量沉 淀富集初級內體， 有助于該領域的研究。

試劑盒組分

1.  緩沖液 A    15ml

2.  緩沖液 B    15ml

3. 2 根塑料研磨棒

4. 20 個離心管柱

5. 20 個收集管

6.  組織分離粉  2.5 克

所需附加材料

1XPBS
渦旋震蕩儀
臺式離心機

儲存：
儲存于 4oC

重要產品信息

1.  仔細閱讀整個操作說明。 將離心管柱和接收管套管放置于冰上預冷。

2.  所有離心步驟都需要在 4 oC 室溫下或者低溫離心機中進行。

3.  研究蛋白磷酸化，  磷酸酶抑制劑應在使用前加入緩沖液 A 中。蛋白酶抑制劑可以選擇添加或不添加， 如添加在使用前加入緩沖液 A 中。

4.  推薦使用 BCA 試劑盒用于蛋白濃度測定

操作方法：

1.   將離心管柱及接收管套管放在冰上預冷。
2. 培養的細胞樣品。 低速離心 （500-600xg， 5 分鐘）  收集 10-30 X 106 細胞， 接第 3a 步。  組織樣品接第 3b 步。
3. 3a.  用預冷的 PBS 清洗細胞，  *去除上清，  加 500ul 緩沖液 A 將細胞重懸，  并放置于冰上孵育5- 10 分鐘，   大力渦旋振蕩 10-30 秒，立即將細胞懸液轉移至離心管柱中，接第 4 步。
3b.  組織樣品。  將 10-20mg 組織樣品（新鮮或冷凍）  放置于離心管柱上，   加 200ul 緩沖液 A，用 塑料棒反復擠壓扭轉研磨 1 分鐘。（注：如果樣品是骨骼肌和心肌，  建議在研磨時添加 80- 100mg 組織分離粉到離心管柱上）再加入 300ul 緩沖液 A 到離心柱里，用移液器上下吹打幾次， 開蓋冰上孵育 5 分鐘，接第 4 步。
注意： 一些未均質組織的存在不會影響樣品的質量。塑料棒可以重復使用，用 70%的酒精清洗即可。
4.  蓋上蓋子，   16000xg 離心 30 秒  （建議使用可在 10s 內升至 16000Xg 的臺式離心機）。離心后可將收集管中的樣品重懸，再過一次柱子以增加最終內體的產量。
5.   棄去離心管柱，  將收集管的液體渦旋振蕩混勻 10 秒，  700xg 離心 2-3 分鐘  （沉淀為完整的細胞核和一些未破裂的細胞）
6. 將上清轉移至一個新的 1.5ml 離心管中，   16000xg， 4oC 離心 30-60 分鐘（延長離心時間可以提高 純度）。離心后，再次將上清轉移至一個新的 1.5ml 離心管中  （沉淀為大的細胞器和質膜）。
7.  估算管中溶液體積，   加入一半體積的緩沖液 B,振蕩混勻 （樣品與緩沖液 B 的比例為 2：1， 也可以根據最終內體得率按照 0.25：1 或者 1：1 減少或增加緩沖液 B 的量）  4oC 孵育 1h 或過夜（延 長時間可以增加產量）。
8.10000xg， 4oC 離心 30 分鐘， 棄掉上清 （上清是胞漿組分， 可選擇保留） ， 沉淀即是內體。產 量通常在 20- 100ug 每個樣品。  內體可以根據下游實驗選擇任何溶解液重懸溶解。推薦使用下 表中 MinuteTM 系列溶解液溶解內體蛋白。

推薦按照下游實驗應用選擇以下蛋白溶解液