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上海雅吉生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： 培養(yǎng)原代細(xì)胞,細(xì)胞系價(jià)格,耐藥細(xì)胞株,實(shí)時(shí)熒光pcr試劑盒 |
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更新時(shí)間：2019-06-25 09:34:43瀏覽次數(shù)：201
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1 、實(shí)時(shí)PCR原理
番茄潰瘍病菌PCR試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可重復(fù)性的定量長期以來一直是科學(xué)家和研究者的目標(biāo)。傳統(tǒng)的方法需要對終產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。
這種方法可以確定目的產(chǎn)物和競爭產(chǎn)物的大小，估算純度，計(jì)算條帶強(qiáng)度。然而，所用擴(kuò)增試劑和體系的變動(dòng)會(huì)造成擴(kuò)增的終產(chǎn)物的重復(fù)性有較大的變動(dòng)，成為這種方法的主要弊端.
擴(kuò)增過程的指數(shù)期提供給我們有用的，可重復(fù)的數(shù)據(jù)。在起始的目的DNA量與循環(huán)過程的指數(shù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物量之間存在著定量關(guān)系。這正是實(shí)時(shí)擴(kuò)增的基礎(chǔ)。
隨著DNA內(nèi)嵌染料和探針特異性化學(xué)的發(fā)展，實(shí)時(shí)探測量子學(xué)的跳躍發(fā)展推動(dòng)了對擴(kuò)增過程的研究進(jìn)展。
今天的實(shí)時(shí)設(shè)備由熒光讀數(shù)計(jì)和熱循環(huán)儀組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實(shí)時(shí)設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實(shí)時(shí)分析軟件以圖表的形式顯示。
在擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中至少收集一次熒光數(shù)據(jù)來進(jìn)行擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)控。用戶能夠根據(jù)一個(gè)一個(gè)的循環(huán)知道那個(gè)樣品正在擴(kuò)增。這些即時(shí)的數(shù)據(jù)允許用戶看清楚各個(gè)樣本相對于標(biāo)準(zhǔn)品，陽性對照和陰性對照是如何擴(kuò)增的。用戶不僅能在擴(kuò)增過程中監(jiān)督整個(gè)反應(yīng)，還可以根據(jù)反饋的信息來優(yōu)化相應(yīng)程序。因此增加了敏感性，特異性和有效性。
原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實(shí)時(shí)設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正常化處理來彌補(bǔ)背景熒光的差異。正常化后可以設(shè)定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。
樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù)）。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為大，這樣可以獲得準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時(shí)擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計(jì)算未知樣品的濃度。
2、 探測化學(xué)物質(zhì)
有5種主要類型的探測化學(xué)物質(zhì)用于實(shí)時(shí)擴(kuò)增，包括：
2.1 內(nèi)嵌染料
2.2 雙標(biāo)記探針
2.3 FRET探針
2.4 分子信標(biāo)
2.5 Ampliflor
2.1內(nèi)嵌染料（Sybr-Green I ）
內(nèi)嵌染料，例如Sybr-Green I ，能與雙鏈DNA結(jié)合
1 SG不與單鏈DNA結(jié)合，熒光信號強(qiáng)度較低
2 SG與雙鏈DNA結(jié)合，熒光信號強(qiáng)度極大的增強(qiáng)
番茄潰瘍病菌PCR試劑盒SG是一種熒光染料，能結(jié)合到DNA雙螺旋的小溝。處于溶解狀態(tài)的未結(jié)合染料顯示低的熒光強(qiáng)度，一旦結(jié)合到雙鏈DNA之后熒光信號增強(qiáng)。這種特性被利用在實(shí)時(shí)擴(kuò)增中。由于在擴(kuò)增反應(yīng)中DNA增加，染料結(jié)合到擴(kuò)增產(chǎn)物上，熒光信號增強(qiáng)。
熒光信號相對背景水平的增加進(jìn)行分析。根據(jù)擴(kuò)增子的長度有多個(gè)熒光染料的分子結(jié)合到雙鏈DNA上。內(nèi)嵌染料可以和所有其他傳統(tǒng)擴(kuò)增成分，例如水，緩沖液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到擴(kuò)增反應(yīng)管中。
因?yàn)椴恍枰O(shè)計(jì)序列特異性探針和新的引物對，這種方法是一種簡便，性價(jià)比較高的實(shí)時(shí)監(jiān)測方法。
