腺相關病毒(AAV)具有無致病性、高效的長期基因表達、易于基因操作以及免疫反應低(或在許多情況下缺乏)的特點，這一系列特性使其成為用于基因治療遞送的重要載體。然而，AAV制造過程復雜，限制因素多，已成為整個行業的瓶頸。

      由于存在圍繞貼壁培養放大的復雜性和勞動密集型問題，因此一些公司在策略上決定使用懸浮培養而不是貼壁培養來生產病毒載體。

由貼壁培養過渡到放大規模的懸浮培養的過程需要適應細胞，這可能需要幾個月的時間，而且并不總是成功。這個過程可能會導致生產力下降、生長速度降低以及潛在的遺傳不穩定，細胞基因表達模式的改變也很常見。在這種情況下，盡早使用懸浮培養生產病毒載體的策略，有望大大簡化工業化的大規模生產。

      值得注意的是，大規模生產工藝是保證高產量和可靠的AAV病毒載體商業化制造過程的關鍵，這依賴于穩健的大規模瞬時轉染過程。專業且富有實戰經驗的轉染試劑供應商可以為高效穩健的轉染過程提供重要支持，Polyplus-transfection是面向基因和細胞治療市場的GMP轉染試劑供應商，也是一家從最初的工藝開發到商業化向病毒制造商提供廣泛的技術和監管支持的轉染試劑供應商。2018年，該公司推出了用于生產治療性病毒的GMP兼容轉染試劑（PEIpro-GMP）。

      近期，Polyplus-transfection公司推出了一款基于化學成分且不含動物源的陽離子納米技術的轉染試劑FectoVIR-AAV，專為懸浮細胞體系規模化生產AAV而開發，可用在基因和細胞治療領域。

      FectoVIR-AAV適用于各種規格的搖瓶、轉瓶、細胞培養袋和生物反應器中無血清懸浮培養的DNA轉染，且兼容在細胞培養過程中抗生素的使用。

      FectoVIR-AAV可以解決現有轉染試劑在AAV生產過程中的局限性，以下部分將展開描述現有挑戰，以及FectoVIR-AAV對比其他轉染試劑的優勢。

高性能：懸浮培養系統中rAAV的高產量

      FectoVIR-AAV轉染試劑是一種新型的基于化學物質的不含動物成分的轉染試劑，其設計目的是解決當前rAAV病毒載體產量和工業可擴展性方面的限制。

與PEIpro轉染試劑和其他競品相比，FectoVIR-AAV轉染試劑在懸浮細胞培養系統中生產rAAV病毒載體方面表現出高性能。FectoVIR-AAV可重復性地大幅提高AAV的產量，與其他競品(PEImax)相比，增幅高達10倍(如下圖)。

▲ 與競品相比，FectoVIR-AAV可提高病毒基因組的生產效率和包裝效率，從而使功能性rAAV-2-GFP的產量提高10倍。

      可擴展性：專為小規模到大規模生產而開發

可擴展性是保證高產量和可靠的rAAV病毒載體生產過程商業化的必要條件。大規模rAAV病毒載體的制造依賴于一個穩健的大規模瞬時轉染過程。大規模瞬態轉染意味著需要在給定的時間框架內制備大量轉染復合物并將其添加到懸浮液細胞中，以便高效轉染。FectoVIR-AAV專門用于大規模轉染，可以解決AAV制造過程中體積和時間限制方面的局限性。

轉染復合物體積：

      通常，轉染復合體積占最終細胞培養體積的10％，這在擴大生產規模時可能會導致技術限制。FectoVIR-AAV經過優化，可將絡合量降低至1％，從而有助于制備用于大規模生產的轉染復合物。例如，對于200 L的細胞懸液體積，轉染復合體積可以從20 L (10％)降至2 L (1％)進行優化。

▲ 優化的FectoVIR-AAV轉染復合物制劑，可進行大規模瞬時轉染。

轉染孵育時間：

      大規模瞬時轉染需要向懸浮細胞培養物中添加更大體積的轉染復合物，這意味著更長的轉移時間。使用FectoVIR-AAV，轉移時間不再是可以導致病毒滴度產量變化的限制因素。FectoVIR-AAV轉染復合物顯示出極大的穩定性：將FectoVIR-AAV轉染試劑和質粒DNA混合后，可以在6h內可靠地將轉染復合物添加到細胞中，而rAAV滴度產量沒有明顯變化。

▲ FectoVIR-AAV/ DNA復合物的長期穩定性可確保工業規模的可靠滴定度。

靈活性：與各種商業培養基和細胞系統兼容

      合成細胞培養基的選擇特定于每個rAAV制造平臺。FectoVIR-AAV/DNA復合物的效率已在不同的市售合成復合介質中進行了全面測試，并且效價收率在各種測試介質中的變化很小。

▲ FectoVIR-AAV與幾種可用于懸浮HEK-293細胞的合 成培養基兼容。

      總的來說，與基因/細胞治療金標準領域的金標準PEIpro相比，FectoVIR -AAV可獲得其2-3倍高感染滴度的病毒載體，且整個操作過程增加了更多的彈性。轉染時復合物的穩定性可延長至6小時，復合物工作體積由10%減至1%，此外，DNA的用量也可減少25%，在減少成本的同時給大規模瞬時轉染提供了諸多便利。GMP級用于臨床試驗的產品也已經上市。

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