珠子抗體-Anti-GFP標簽馬伯瓊脂糖共軛(避重輕鏈特制款)數據表產品描述收起

綠色熒光蛋白廣泛應用于蛋白定位和蛋白動力學分析。GFP-beads是GFP-tag抗體與瓊脂糖凝膠微球(瓊脂糖)偶聯,專門用于純化和檢測細胞裂解液或菌體裂解液中的GFP標簽蛋白。適用于IP實驗。當細胞或菌體裂解液與本試劑混合,樣本中的GFP標簽重組蛋白與GFP珠子特異性結合,其他雜蛋白不結合。本試劑結構穩定,結合GFP標簽蛋白效率高。IP產物可以應用于質譜分析,酶活性測定等生化分析手段中。本產品是特別制備的GFP珠子產品,使用該產品進行IP實驗,在后續的IP-WB步驟中,可以*避免抗體輕重鏈的條帶出現。

產品儲存收起

儲存于4°C,禁止凍存。保質期12個月。

使用指南收起

1. 收集細胞：

對于一個免疫共沉淀反應,推薦使用106 - 107個表達GFP融合蛋白的哺乳動物細胞。服出培養液,加lml預冷PBS于細胞中并刮下細胞,之后將細胞轉入預冷管中。4℃,500克離心3分鐘,棄上清液。用預冷PBS洗兩遍細胞沉淀物,輕輕重懸細胞。

2. 裂解細胞：

(1)用200μl預冷的裂解緩沖重懸細胞。

注:在裂解緩沖中加入蛋白酶抑制劑(推薦使用雞尾酒類型的蛋白酶抑制劑,貨號A10004:200X蛋白酶抑制劑復合物)

(2) 將離心管放在冰上30分鐘，每10分鐘重懸一次細胞。

(3) 16000克,4℃離心10分鐘,將上清轉移到一個新的預冷離心管中,加300μ1稀釋緩沖,丟掉沉淀。

注:在這步細胞溶解物可放入-80℃長期保存。同樣需要在在稀釋緩沖中加入蛋白酶抑制劑。

3.平衡珠子:渦旋anti-GFP瓊脂糖,吸取25μ1 anti-GFP瓊脂糖至預冷500μ1稀釋緩沖中,1200克,4℃離心2分鐘,去掉上清,重復兩次。

4. 結合蛋自：

(1)將第3步獲得的細胞蛋白提取液加入平衡后的anti-GFP瓊脂糖中(如有需要,可取50μ1上清液作為輸入對照用于兔疫印跡分析),在4℃環境中上下顛倒孵育1小時。

(2) 1200克,4℃離心2分鐘,去掉上清。

5. 洗anti-GFP瓊脂糖:重懸于GFP珠子500μl預冷的溶解液中,1200克,4℃離心2分鐘,去掉上清,重復2 - 3次。

可選做:在第二次清洗中將鹽濃度提高到500毫米。

6. 洗脫結合蛋白：

(1) 100μl SDS加載緩沖重懸anti-GFP瓊脂糖。

(2)將anti-GFP瓊脂糖在95℃中加熱10分鐘,使免疫復合物分離出來。1200克,4℃離心2分鐘,取上清跑sds - page。

(3)如果后續IP產物需要進行質譜鑒定,可以使用以下方法來替代步驟(1)和(2):加50μl 0.2 m,鹽酸重懸anti-GFP瓊脂糖,保持混勻狀態孵育30年代,1200 g, 4℃離心2分鐘。將上清轉移至新的離心管中,加入5μl lM PH10.4的三羥甲基氨基甲烷基液中,和可重復此步驟來增加洗脫效率。

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