Y190菌株是Clontech 公司開發的GAL4系統酵母雙雜實驗用菌株,MATa 型,可直接轉化質粒或與 MATa 型酵母菌株 Y187 通過 mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗.Transformation marker為:trpl,leu2.cvh2;報告基因為:lacZ,HIS3,MELLY190-GAL4 酵母雙雜系統需要兩種質粒配套使

用:(pGB和DACT2)或(pGBKT7和pGADT7)。質粒pGB由 pGBKT7改造而來,篩選標志為TRP1 用

于表達DNA-BD(來自酵母轉錄因子GAL4N 端 1~174位氨基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白:質粒 pACT2 與pGADT7 的結構和功能類似,篩選標志為 LEU,用于表達 AD(GAL4C端 768~881位氨基酸)與目標蛋白(Prev)的融合蛋白。GAL4系統原理:一個完整的酵母轉錄因子 GAL4 可分為功能上相互獨立的兩個結構域:位于N端1~174位氨基酸區段的DNA結合域(DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸區段的轉錄激活域(AD)DNA-BD 能夠識別 GAL4-responsive gene的上游激活序列 UAS.并與之結合。而 AD 可以啟動 UAS 下游的基因進行轉錄。BD 和 AD 單獨存在不能激活轉錄,但當二者接近時,則呈現完整的 GAL4 活性,使含有 UAS 的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下.BD不與AD結合,將要檢測的蛋白質分別與 BD 和 AD 融合，形成 bait 融合蛋白(bait-BD)和prev融合蛋白(prev-AD),如果

bait和prev 發生相互作用,就會促使 BD和 AD的相互接近,形成完整的 GAL4.從而激活報告基天的轉錄

操作方法:

1.Carrier DNA 在每次使用前要通過加熱處理使其變性為單鏈狀態,步驟如下:Carrier DNA放

95℃水浴或金屬浴3min快速插入冰中靜置3min再次放95℃水浴或金屬浴3min快速插入冰中靜置 3min 以上。

*備注:Carrier DNA加入請提前變性處理:95-100℃5min,快速冰浴,重復一次。置于冰浴5min之內使用。

2.取100ul冰上融化的 Y190 感受態細胞,依次加入預冷的目的質粒 0.5-3ug Carrier DNA 10ul

PEG/LiAc 500ul并吸打幾次混勻.30℃水浴 30min (15min 時翻轉 6-8 次混勻)。

3.將管放 42℃水浴 15min (7.5min 時翻轉 6-8 次混勻)。

4.5000rpm 離心 40s棄上清，ddH,O 400ul 重懸,離心30s棄上清

5.ddH?O 50ul 重懸,涂板,29℃培養 48-96h。