AH109菌株來源于PI69-2A酵母菌株，將lacZ報告基因引入PI69-2A誕生了AH109此菌株是Clontech公司開發的GAL4系統酵母雙雜實驗用菌株，MATa型可直接轉化質粒或與MATa型酵母菌株 Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker為:trpl. leu2.報告基因為:lacZHIS3.ADE2MEL1 AH109-GAL4酵母雙雜系統需要兩種質粒配套使用: pGBKT7和pGADT7質粒pGBKT7的篩選標志為TRPL用于表達DNA-BD(來自酵母轉錄因子 GAL4N端1~174位氨基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白;質粒pGADT7的篩選標志為LEU,用于表達AD(GAL4C端768~881位氨基酸)與目標蛋白(Prev)的融合蛋白。GAL4系統原理:一個完整的酵母轉錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結構域:位于N端1~174位氨基酸區段的DNA結合域(DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸區段的轉錄激活域(AD)DNA-BD 能夠識別 GAL4- responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結合。而AD可以啟動UAS下游的基因進行轉錄。BD和AD單獨存在不能激活轉錄，但當二者接近時，則呈現完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下BD不與AD結合，將要檢測的蛋白質分別與BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait-BD)和prev融合蛋白(prev-AD)，如果bait和prey發生相互作用，就會促使BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4.從而激活報告基因的轉錄。AH109有四個報告基因:lacZ.HIS3

ADE2.MEL1分別由三種不同的啟動子(GAL.GAL2 MELL啟動這三種啟動子只有 GAL4 識別

的17bp核心區相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發生的概率。

操作方法:

1.取100ul冰上融化的AH109感受態細胞，依次加入預冷的目的質粒2-5ug,Carrier DNA(95

100℃5 min快速冰浴重復一次)10ulPEG/LiAc500ul 并吸打幾次混勻.30℃水浴 30mir(15min時翻轉6-8次混勻)。

*備注:Carrier DNA 加入請提前變性處理:95-100℃ 5min快速冰浴，重復一次。置于冰浴 5min之內使用。

2.將管放42℃水浴15min(75min時翻轉6-8次混勻)。

3.5000rpm離心40s棄上清ddH400ul重懸離心30s棄上清。

4.ddH O50ul重懸，涂板，29℃培養48-96h