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SpCas9 來源于 S. pyogenes 菌株，是依賴于 crRNA 和 tracrRNA(或連接后形成的 sgRNA)引導的 DNA內切核酸酶，在靶標雙鏈 DNA 存在 PAM(NGG)的情況下，特異地切割靶標雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成平末端。PAM 對于 SpCas9 的識別和切割都是必需的，其切割位點位于目標序列(target sequence)內，離 PAM 區 3 個堿基。SpCas9 酶的 HNH 和 RuvC 結構域分別負責切割靶標雙鏈 DNA 中與 sgRNA 配對和非配對的鏈。本產品中，SpCas9 的 H840 和 D10 都被突變為 A，從而使其 HNH 和 RuvC 功能域失活，獲得了 Sp-dCas9 酶。因此，Sp-dCas9 只有結合靶標 DNA 的活性，而沒有切割靶標 DNA 的活性。
產品組分
組分 | 32102-01 (100 pmol) | 32102-03 (1,000 pmol) |
Sp-dCas9 Nuclease (10 μM)a | 100 pmol | 1,000 pmol |
10× TOLO Buffer 3 | 1 mL | 1 mL |
a. Sp-dCas9 Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規格的總體積為 100 μL； n
保存條件
-20℃儲存；≤ 0℃運輸。
實驗流程
1. Sp-dCas9 與靶標 DNA 結合實驗
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × TOLO Buffer 3 | 2 μL | 1 × |
10 μM Sp-dCas9 Nuclease | 1.5 μL | 750 nM |
10 μM sgRNA | 1.5 μL | 750 nM |
1 μM Substrate DNA | 3 μL | 150 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
37℃反應 30 min，可通過非變性核酸電泳對實驗結果進行檢測。
實驗結果
為了驗證 Sp-dCas9 與 target DNA 的結合，我們通過 5′端帶 FAM 基團的引物在全長 59 bp 的 targetdsDNA 末端加上 FAM 標記。在 20 μL 反應體系中加入 2 μL的 10 × TOLO Buffer 3, 1.5 μL 的 10 μM Sp-dCas9Nuclease, 1.5 μL 的 10 μM sgRNA, 和 3 μL 的 1 μM target dsDNA-FAM, 然后將結合反應體系在 37℃靜置孵育 30 min，用 2%的瓊脂糖凝膠低溫電泳 100 V，60 min 后，在化學發光成像分析儀(GE ImageQuantLAS4000)上用熒光通道檢測樣本條帶。實驗結果表明，Sp-dCas9 + sgRNA + target dsDNA-FAM 泳道電泳跑膠遷移速率較慢，說明 Sp-dCas9 在 sgRNA 的引導下特異地識別并結合了 target dsDNA。此外，還可以用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)對 Sp-dCas9 與 target DNA 的結合進行檢測。
注意事項
1. 為防止 RNase 污染，請保持實驗區干凈整潔，操作時需穿戴干凈的手套、口罩，實驗所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。
2. 因反應需添加 RNA(sgRNA 或者 crRNA:tracrRNA)，整個體系，包括 Sp-dCas9 酶都必須不含任何其它核酸酶活性。本產品經過嚴格質控，無任何其它核酸酶污染。
3. 反應結束后，可以采用非變性聚丙烯酰胺（或瓊脂糖）凝膠電泳的方式來檢測 Sp-dCas9 是否結合靶標雙鏈 DNA。電泳緩沖液體系可使用 DEPC 處理以消除 RNase 的影響；同時，應保持低溫下電泳，相關要求可參考 RNA EMSA 體系。
4. Sp-dCas9 酶對熱敏感，容易失活，應全程冰上配置反應體系，使用后立即置于-20℃保存。
5. 本產品僅供科研使用。若進行商業用途，需聯系zhuanli持有方獲取相關的zhuanlishouquan。
