正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

生物體內(nèi)超氧陰離子等活性氧具有免疫和信號(hào)傳導(dǎo)的作用，但積累過(guò)多時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞膜及生物大分子產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病。

測(cè)定原理：

超氧陰離子與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO₂^－，NO₂^－在對(duì)氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成紅色的偶氮化合物，在530nm處有特征吸收峰，根據(jù)ΔA值可以計(jì)算樣品中O₂^－含量，反應(yīng)式為NH₂OH + 2O₂^－ ＋H^＋ → NO₂^－ ＋ H₂O₂ ＋ H₂O。

試劑組成和配制：

自備儀器和用品：

天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、氯仿和蒸餾水。

超氧陰離子提取：

1、植物、動(dòng)物組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后，10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、血清或培養(yǎng)液：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至530nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

混勻，37℃水浴20min

混勻，37℃水浴20min

混勻，8000g，25℃，離心5min，小心吸取上層水相200μl于微量石英比色皿/96孔板中，測(cè)定A530。ΔA=A測(cè)定-A空白，空白管只要做一管。

超氧陰離子含量計(jì)算公式：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0242x - 0.0027，R²=0.9980

1. 組織：

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

超氧陰離子含量（nmol/g 鮮重）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷(V樣÷V樣總×W)×2

                             =148.76×(ΔA+0.0027)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ g·min）=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T

                                =7.44× (ΔA+0.0027)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

超氧陰離子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷(V樣×Cpr)×2

                                             =148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ mg prot·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

                                      =7.44× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 細(xì)菌，真菌：

超氧陰離子含量（nmol/10⁴ cell）= (ΔA+0.0027)÷0.0242× V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)×2

= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/10⁴ cell·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子 含量（nmol/ml）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷V樣×2

=148.76× (ΔA+0.0027)

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ml·min）= 148.76× (ΔA+0.0027) ÷T

= 7.44× (ΔA+0.0027)

V樣總：加入提取液體積，1 ml； V反總：反應(yīng)總體積，0.36ml；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；2: 2分子O₂^－參與反應(yīng)生成1分子NO₂^－。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0121x - 0.0027，R² = 0.9980

1. 組織：

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

超氧陰離子含量（nmol/g 鮮重）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V反總÷(V樣÷V樣總×W)×2

                             =297.52× (ΔA+0.0027)÷W

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ g·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷W÷T

                                =14.88× (ΔA+0.0027)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

超氧陰離子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V反總÷(V樣×Cpr)×2

                                             =297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ mg prot·min）= 297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

                                      =14.88× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 細(xì)菌，真菌：

超氧陰離子含量（nmol/10⁴ cell）=(ΔA+0.0027)÷0.0121× V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)×2

=297.52× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/10⁴ cell·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量÷T

=14.88× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清或培養(yǎng)液

超氧陰離子 含量（nmol/ml）=(ΔA+0.0027)÷0.0121 ×V反總÷V樣×2

=297.52×(ΔA+0.0027)

超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ml·min）= 297.52×(ΔA+0.0027) ÷T

=14.88×(ΔA+0.0027)

V樣總：加入提取液體積，1 ml； V反總：反應(yīng)總體積，0.36ml；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；2：2分子O₂^－參與反應(yīng)生成1分子NO₂^－。

注意事項(xiàng)：

1、OD值大于1，樣品適當(dāng)稀釋再測(cè)定，注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、樣品制備好后，立刻進(jìn)行測(cè)定，請(qǐng)勿將樣品進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的低溫保存，以免影響測(cè)定結(jié)果。

3、試劑四有一定的毒性，請(qǐng)操作時(shí)做好防護(hù)措施。