DB3.1電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。此感受態(tài)細(xì)胞是采用特殊工藝處理得到的感電擊感受態(tài)細(xì)胞。該細(xì)胞含有g(shù)yrA462 基因，對(duì)ccdB基因產(chǎn)物的毒性具有抵抗作用，適用于轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增包含ccdB基因的質(zhì)粒載體。使用pUC19質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)10°cfu/μg DNA

以上。基因型為:FgyrA462 endA1 Δ(srl-recA) mcrB mrr hsdS20(r, me) supE44ara-14 galK2lacY1 proA2 rpsL20(Sm") xyl-5λ- leu mtl1產(chǎn)品特點(diǎn):

適用于轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增包含ccdB基因的質(zhì)粒載體;ANBN具有l(wèi)iusuanlianmeisu抗性;轉(zhuǎn)化效率10cfu/μg DNA 以上。

操作步驟:

以下操作均按無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行:

1.0.1cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5min待其瀝干水分,正置5min使乙醇充分揮發(fā)，

待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5min充分降溫。

2.取-70C保存的DB3.1電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5min,待其融化,加入目的DNA(質(zhì)粒或連接產(chǎn)物)并用手

boda離心管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。

A.測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用1ul 0.lng/ul的對(duì)照質(zhì)粒pUC19;

B.對(duì)于連接產(chǎn)物,請(qǐng)用乙醇沉淀DNA后加入適量TE級(jí)沖液(10mM Tris-HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重懸,

DNA 濃度不超過(guò)100ng/μl,體積不超過(guò)5μl/50μl感受態(tài)。

3.用200μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上杯蓋。

4.啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25μF,PC=200Ω,V=1.8kV(BioRad電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù));也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參

數(shù)操作。將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中。

5.2min后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700ul不含抗生素的無(wú)菌S.O.C.培養(yǎng)基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊

杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到50ml離心管(BD Falcon50ml 錐形離心管等),向離心管中補(bǔ)加S.O.C.培養(yǎng)基至10ml

傾斜 45度放入搖床,37℃,225rpm復(fù)蘇60min。

6.5000rpm 離心1min 收菌,重懸后取100-200μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,若全部涂

板請(qǐng)選用直徑 15cm 培養(yǎng)皿2-5個(gè))。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)13-17h。