1.加樣：

①實驗樣本過多時，可分批次操作，以減少實驗時間延長造成的誤差；
②加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；
③作定量試驗時，使用加樣器加注試劑，并經(jīng)常校正其準確性，此外，要做到一份樣本一個移液頭，防止交叉污染。
2.溫育：
①如有兩種溫度，盡量使用較低的溫育溫度、較長反應(yīng)時間的條件；
②用1個小溫度計放置在板孔反應(yīng)液中測量觀察；
③96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學梯度會造成“邊緣效應(yīng)"，因此盡量采用水浴；
3.洗板：
①手工洗板時，拍板時要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離；
②洗板機洗板時應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出；
③為了洗滌效果好，實驗室可采用機器與人工洗滌相結(jié)合的方法，在機器洗滌后再進行人工洗板1-2次，或適當增加洗板的次數(shù)；
4.顯色：
ELISA試劑盒中，如以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以鄰苯二胺(OPD)為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑。顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15-30 min。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑，要臨用前30 min配制且必須避光。以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光，但A、B液應(yīng)盡量避免接觸金屬器械。
5.判定：
讀取結(jié)果要在15-30 min內(nèi)完成，定性測定用肉眼判讀試驗結(jié)果時，反應(yīng)板應(yīng)水平距離白色背景10-15 cm；定量測定時用酶標儀讀取結(jié)果，酶標儀不應(yīng)置于陽光或強光照射下，需先預(yù)熱15-30 min再進行測試。