PCR特異性：
1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當然，不是說越長越好，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩定性；
4)避免3'端GCrich，個BASE不要有GC，或者5個有3個不要是GC。
5)避免3'端的互補，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯配；
7)避免內部形成二級結構；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時不算，但在檢測互補和二級結構要加上它們；
9)使用兼并primer時，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學會使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。

產品名稱：萊氏泰勒蟲探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：Theileria lestoquardi
貨號：XG01P4162
分類：熒光定量PCR試劑盒
儲存條件：-20℃避光保存，避免反復凍融。
運輸：低溫、避光，快遞免費送貨上門。

熒光定量PCR實驗步驟：
①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
實時定量PCR：
①β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應體系如下：
標準品反應體系
序號  反應物  劑量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  陽性模板上游引物F  0.5μl
3  陽性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  陽性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

金龜子綠僵菌 Metarhizium anisopliae黑木耳 Auricularia auricula

大鼠腦靜脈血管內皮細胞*培養基斯氏普羅菲登斯菌 Providencia stuartii

淡紫擬青霉 Paecilomyces lilacinus毛柄金錢菌(金針菇) Flammulina velutipes

小鼠直腸平滑肌細胞*培養基UACC-812(人腺導管瘤細胞)

Raji(人Burkitt's淋巴瘤細胞)中慢生華癸根瘤菌 Mesorhizobium huakuii

III型膠原酶(含100mL酶解緩沖液)ACHN(人腎細胞)

人參刺盤孢 Colletotrichum panacicolaSNU-5(人胃細胞)

酒假絲酵母 Candida kefyrCOS-7(非洲綠猴SV40轉化的腎細胞)

圍小叢殼 Glomerella cingulata

大鼠成年表皮角質形成層細胞*培養基100mL

大豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum

小鼠肝動脈平滑肌細胞*培養基100mL

 I型膠原酶(含100mL酶解緩沖液)10mL
萊氏泰勒蟲探針法熒光定量PCR試劑盒4,6-甲基嘧啶

(甲基)甲基硅烷

(甲基)甲基硅烷

2-(2H-Tetrazol-5-yl)-Phenylboronic Acid

2-(2H-Tetrazol-5-yl)-Phenylboronic Acid

2-溴-1,3-氟-5-苯

1-溴-2,3,5,6-四氟苯

1-溴-2,3,5,6-四氟苯

5-溴-2-基苯腈

順-雙(三苯基膦)鉑(II), Pt min

基因反應體系：
序號  反應物  劑量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  內參照上游引物F  0.5μl
3  內參照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待測樣品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環。