96孔板測定示例

概述

準備AST反應混合物（50μL）

加入AST標準品或測試樣品（50μL）

孵育于37℃，20-30分鐘或室溫，60分鐘

在Ex / Em = 540 / 590nm處監測熒光增加

注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍組分A和B各一瓶。

操作方法

1.準備AST標準品的連續稀釋液（1至300 mU / mL）：

1.1向DPBS緩沖液中加入所需量的AST陽性對照，制成100 U / mL AST標準溶液。

注意：未使用的AST陽性對照（組分D）應存儲在4℃。 不要凍結。

1.2將3μL100U / mL AST標準溶液（來自步驟1.1）加入含0.1％BSA的997 L DPBS緩沖液中，得到300 mU / mL AST標準溶液。

1.3取300μL300mU / mL AST標準溶液進行1：3連續稀釋，得到AST標準品的100,30,10,3,1,0.3和0 mU / mL系列稀釋液。

1.4如說明書中的表1和2中所述，將AST標準品和含有AST的測試樣品的系列稀釋液加入到實心黑色96孔微量培養板中。

注意：如果需要，將測試樣品稀釋至含有0.1％BSA的DPBS緩沖液中的濃度范圍。

2.準備AST測定混合物：

2.1將100μLDdH2O加入到NAD小瓶（組分C）中，得到100X NAD溶液。

2.2將10 mL AST測定緩沖液（組分B）加入AST Enzyme Mixture瓶中（組分A），并充分混合。

2.3將整瓶100X NAD溶液（來自步驟2.1）加入到AST Enzyme Mixture溶液中（來自Step2.2）使用AST測定混合物。

注意1：該AST測定混合物足以用于兩個96孔板。 在室溫下不穩定，應在2小時內及時使用，避免暴露在光線下。

注意2：或者，可以通過向組分A的瓶中加入200μLH2O制備50倍的AST酶混合物原液，然后通過將原液與測定緩沖液（組分B）和100x NAD混合制備AST測定混合物。 按比例解決。 將未使用的50X AST Enzyme Mixture儲備液和100X NAD溶液分裝并儲存在-20℃，避免凍融循環。

3.運行AST測定：

3.1將50μL的AST測定混合物（來自步驟2.3）加入AST標準品，空白對照和測試樣品的每個孔中（參見步驟1.4），使得總AST測定體積為100μL/孔。

注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLAST測定混合物。

3.2將反應在37°C下孵育20-30分鐘或在室溫下孵育60分鐘，避光。

注意：空白控制的背景隨著時間和溫度的增加而增加。 如果在37℃下孵育30分鐘，背景將很高。

3.3用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的熒光板讀數器監測熒光增加（佳Ex / Em = 540 / 590nm，在570nm處截止）。