適用儀器

樣品實驗方案

簡要概述

1. 準備細胞密度為0.5-1×10 6細胞/ mL

2. 用測試化合物處理細胞以誘導超氧化物

3. 將1 µL 500X MitoROS 580加到0.5 mL細胞懸液中

4. 將細胞在37°C染色1小時

5. 使用帶有FL2通道的流式細胞儀檢測熒光強度

溶液配制

儲備溶液配制

1. MitoROS 580儲備溶液（500X）：將100 µL DMSO（組分C）添加到MitoROS 580（組分A）小瓶中，并充分混合以制成500X MitoROS 580儲備溶液。避光。注意：請密閉存放。

實驗步驟

1. 對于每個樣品，在自備的0.5 mL生長培養基或緩沖液中制備細胞，密度為5×10 5至1×10 6個細胞/ mL。注意：應單獨評估每種細胞系，以確定超氧化物誘導的細胞密度。
   
   

2. 在分析緩沖液（組分B）或自備的緩沖液（例如PBS）中用25 µL 20X測試化合物處理細胞以誘導超氧化物。對于對照細胞（未處理的細胞），添加相應量的化合物緩沖液。
   
   

3. 將細胞在37°C孵育至少30分鐘。注意：將 Jurkat細胞在37°C下用50 µM抗霉suA（AMA）處理30分鐘以誘導超氧化物。有關詳細信息，請參見圖1。
   
   

4. 將0.5 µL細胞懸浮液中加入1 µL 500X MitoROS 580儲備液。
   
   

5. 在37°C下孵育1小時。注意：對于貼壁細胞，用0.5 mM EDTA輕輕提起細胞以保持細胞完整，并在MitoROS 580孵育之前用含血清的培養基洗滌一次。適當的孵育時間取決于單個細胞的類型和測試使用的化合物。

6. 使用帶有FL2通道的流式細胞儀（Ex / Em = 488/590 nm）檢測熒光強度。