天根-無內毒素質粒小提中量試劑盒 -DP118采用硅膠膜吸附技術，高效專一地結合質粒DNA。同時采用特殊的溶 液P4和過濾柱CS，可有效的去除內毒素、蛋白等雜質；整個提取過程僅需1個小時，方便快 捷。以下操作步驟適用于提取5-15 ml過夜培養的大腸桿菌，質粒提取得率和質量與宿主菌的 種類和培養條件，細胞的裂解，質粒拷貝數，質粒的穩定性，抗生素等因素有關。 使用本試劑盒提取的質粒DNA可適用于轉染多種細胞及各種常規操作，包括酶切、 PCR、測序、連接等實驗。 提取得率 質粒類型 菌液量 得率 質粒 低拷貝 5-15 ml 5-25 µg pBR322, pACYC及其衍生載體, pSC101 及其衍生載體, SuperCos, pWE15 高拷貝 5-15 ml 15-70 µg pTZ, pUC, pBS, pGM-T 注意事項 請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。

儲存條件

      本試劑盒在室溫（15-25℃）干燥條件下，可保存12個月；更長時間的保存可置于 2-8℃。（注意：當低溫貯存時，使用前應將試劑盒內的溶液在室溫中放置一段時間，必要 時可在37℃水浴中預熱10 min，以平衡溶液溫度）。單獨包裝的RNaseA在室溫可穩定保存 12個月以上。加入RNaseA后的溶液P1應置于2-8℃保存，可穩定保存6個月。

 試劑盒使用注意事項

1．溶液P1在使用前 加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。

2．次使用前應按照試劑瓶標簽的說明 在漂洗液PW中加入無水乙醇。 3．使用前檢查平衡液BL、溶液P2和P4是否出現渾濁，如有混濁現象，可在37℃水浴中加 熱幾分鐘，即可恢復澄清。

4.注意不要直接接觸溶液P2和P4，使用后應立即蓋緊蓋子。

5.所有離心步驟均為使用臺式離心機室溫下進行離心，速度為12,000 rpm (~13,400×g )。

 6．提取的質粒量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質粒或 大于10 kb的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、P4的用量，洗脫緩 沖液應在65-70℃預熱。可以適當的延長吸附和洗脫的時間，以增加提取效率。

 7．實驗前使用平衡液處理吸附柱，可以充分激活硅基質膜，提高得率。

 8．用平衡液處理過的柱子 好當天使用，放置時間過長會影響效果。

TIANGEN-天根無內毒素質粒小提中量試劑盒-操作步驟

• 1. 柱平衡步驟：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請 使用當天處理過的柱子）
• 2. 取5-15 ml過夜培養的菌液加入離心管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 min，盡量吸 除上清。 注意：菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中, 菌體量以能夠充分 裂解為佳，過多的菌體裂解不充分會降低質粒的提取效率。
• 3. 向留有菌體沉淀的離心管中加入500 μl溶液P1 （請 檢查是否已加入RNaseA），使用 移液器或渦旋振蕩器懸浮細菌細胞沉淀。
•  注意：請務必懸浮細菌沉淀，如果有未混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量 和純度偏低。
• 4. 向離心管中加入500 μl溶液P2，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。 注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA。此時菌液應變得清亮粘稠， 所用時間不應超過5 min，以免質粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂 解不，應減少菌體量。
• 5. 向離心管中加入500 μl溶液P4，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時會出現白色 絮狀沉淀，然后室溫放置10 min左右，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心10 min，此時在離 心管底部形成沉淀。 注意：P4加入后應立即混合，避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再 次離心后取上清。
• 6. 將上一步收集的上清液分次加入過濾柱CS（過濾柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g ) 離心2 min，濾液收集在干凈的2 ml離心管中（自備）。
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• 7. 向濾液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇（加入異丙醇過多容易導致RNA污染），上下顛倒 混勻后轉移到吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）。 注意：過濾后濾液會損失，根據損失的不同請加入不同體積的異丙醇。吸附柱CP4的  大容積為700 μl，所以需要分次過柱。
•  8. 室溫12,000 rpm (~13,400×g)離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集 管中。 注意：將第7步中所得溶液分次過柱，每次均按以上條件操作。
•    9. 向吸附柱CP4中加入500 μl去蛋白液PD，12,000 rpm (~13,400×g )離心1 min，倒掉收 集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。
•   10. 向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW（請 檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。 注意：加入漂洗液PW后，如果室溫靜置2-5 min，有助于更好地去除雜質。
•   11. 向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 min，倒掉收集 管中的廢液。
•   12. 將吸附柱CP4重新放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心2 min，目的是將吸附 柱中殘余的漂洗液去除。 注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實 驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP4開蓋，置于室溫放置數分鐘，以晾干吸 附材料中殘余的漂洗液。
•   13. 將吸附柱CP4置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300 μl洗脫緩 沖液TB，室溫放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 min將質粒溶液收集到離心管 中。

注意事項：為了增加質粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，重復步驟 13。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應保證其pH值在7.0-8.5 范圍內，pH值低于7.0會降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應少于100 μl，體積過小影響 回收效率。且DNA產物應保存在-20℃，以防DNA降解。 質粒DNA濃度及純度檢測 得到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。電泳可能為單 一條帶，也可能為2到3條DNA條帶，這主要與提取物培養時間長短、提取時操作劇烈程度等 有關。OD260值為1相當于大約50 μg/ml雙鏈DNA。 OD260/OD280比值應為1.7–1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值 會偏低，但并不表示純度低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值。