1. 疏水層析的原理：
疏水作用層析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根據分子表面疏水性差別來分離蛋白質和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。由于蛋白質是一類有序三維結構的活性大分子，但其空間排列很容易受到外界環境的影響，極易從有序的結構變成無序結構。當立體結構發生變化時，常常失去原有的活性，即蛋白質的失活。使用適度疏水性的分離介質，在含鹽的水溶液體系中，借助于分離介質與蛋白質分子之間的疏水作用達到吸附活性蛋白分子的目的，這種層析技術稱為疏水作用層析。
蛋白質的一級結構中有很多非極性氨基酸，這些氨基酸在三級結構上由于疏水相互作用會被盡量包在分子內部，但是仍不可避免地有一些非極性側鏈暴露在表面，這些非極性的表面是它和疏水層析介質作用的結合部位。因為蛋白質分子的疏水性不同，它們和疏水層析介質的作用力強弱也不同，所以非極性表面的大小和含量決定了蛋白質分子的疏水性強弱。疏水層析就是利用各種蛋白質分子和疏水功能基團之間作用力的差異對蛋白質進行分離、純化的一種技術。
蛋白質可以看成是一種有親水性外殼包裹著疏水性核心的四級結構的復雜體系。蛋白質表面存在一些非極性的疏水基團，這些基團多為非極性的氨基酸殘基。由于各種基團疏水性的差別、疏水基團暴露數量的不同、疏水區與親水區在數量、大小和分布的不同等因素，使各種蛋白質之間存在較大的差異，同時，對于同一種蛋白質在不同的溶液中，使疏水基團暴露的程度也呈現出一定的差異。由于這種差異，致使各種蛋白質分子與同一種分離介質疏水基團的相互作用不同，吸附能力不同，可以達到分離的目的。
如果在水溶液中加入中性鹽，使溶液處于高鹽濃度時，可以破壞蛋白質分子表面水分子的有序排列，使大分子與分離介質的功能基團之間產生疏水作用。同時，由于高鹽的存在，使蛋白質分子的疏水基團暴露增多，增加了大分子的疏水性，增強了蛋白質分子與分離介質功能基團之間的疏水作用，相互結合力增強。在疏水作用的驅動下，蛋白質分子從溶液中被吸附到分離介質上，改變了蛋白質分子在水相與分離介質相中的分配系數，達到了吸附的目的。
在目標產物被分離介質吸附后，使用低鹽含量的溶液通過層析柱，降低了蛋白大分子與分離介質之間的疏水作用，使目標產品脫離分離介質，擴散到溶液中，達到洗脫的目的。各種大分子的疏水性強度不同，與分離介質之間的疏水作用不同，各有用物質根據疏水性的強弱將依次被洗脫，出現不同的洗脫峰，達到多種物質分離的目的。
2. 疏水層析的優點：
與蛋白質作用條件溫和。疏水作用層析只需改變溶液中的鹽含量，就可以進行吸附或洗脫。操作條件溫和，蛋白質分子結構無明顯變化，蛋白質分子活性回收率高。尤其適用于對環境比較敏感，分子量較大的蛋白質的分離。
選擇性強。在特定鹽濃度下，疏水作用層析介質對蛋白質的吸附選擇性較強，對于疏水性不同的蛋白，只要改變洗脫鹽的濃度，就可以對蛋白實現較好的分離。
具有優良的物理、化學穩定性。分離介質結構穩定，可以有較長的使用壽命，并可長期反復使用。
無環境污染。疏水作用層析在操作過程中，只使用鹽的水溶液作流動相，除介質的再生外很少使用有機溶劑，因此，不會對環境造成危害，易于工業規模生產。
易于和其他層析技術聯合使用。疏水作用層析介質易于和其他層析技術聯合使用，可減少操作步驟，節約生產成本。適用于含鹽量較高，或離子強度較大的溶液中進行蛋白質的吸附分離。
