紫外分光光度計的工作原理主要基于朗伯-比爾定律(Lambert-Beer Law)。
當一束紫外或可見光通過含有吸光物質的均勻溶液時，部分光會被溶液中的吸光物質所吸收，導致光強度減弱。
吸光物質對光的吸收程度與溶液中吸光物質的濃度、光通過溶液的路徑長度(通常稱為光程)以及吸光物質對特定波長光的吸收系數有關。
具體來說，入射光強度(I?)與透過光強度(I)之間的關系可以用朗伯-比爾定律表示為：A = -log (I / I?) = ε × c × l ，其中 A 為吸光度，ε 為摩爾吸光系數(與物質的性質及入射光波長有關)，c 為溶液中吸光物質的濃度，l 為光程。
在紫外分光光度計中，光源發出連續的紫外-可見光，經過單色器分光，得到特定波長的單色光，然后照射到裝有樣品溶液的比色皿中。檢測器測量透過樣品溶液后的光強度，并與入射光強度進行比較，從而計算出吸光度。
通過改變入射光的波長，并測量不同波長下的吸光度，就可以得到物質的吸收光譜。根據吸收光譜的特征峰位置和強度，可以對物質進行定性和定量分析。
例如，在測定蛋白質濃度時，由于蛋白質中的芳香族氨基酸在 280nm 波長處有特定的吸收，通過測量該波長下的吸光度，結合已知的摩爾吸光系數和光程，就可以計算出蛋白質的濃度。
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