單分子測序解析超級細菌

上海雙博生物科技有限公司的研究人員利用PacBio的單分子實時（SMRT）測序技術，解析了與腸桿菌（Enterobacteriaceae）相關的醫院獲得性感染中質粒介導的抗生素耐藥性。

研究人員從2011年爆發“超級細菌”的NIH醫院中采集了革蘭氏陰性的腸桿菌分離株，并分析了其中含有抗生素耐藥性酶的質粒。他們的研究結果顯示攜帶這些耐藥基因的背景質粒的廣泛多樣性，且許多耐藥性相關的質粒來自醫院環境內或外的獨立來源。

為了鑒定腸桿菌攜帶的編碼碳青霉烯酶的質粒，以及它們在細菌物種之間的移動，研究人員對臨床和醫院環境的腸桿菌分離株進行了全基因組測序，如肺炎克雷伯菌，產酸克雷伯菌和大腸桿菌，它們都含有一個或多個碳青霉烯耐藥的質粒。

研究小組主要關注與碳青霉烯酶相關的耐藥性，這涉及到所謂的KPC基因。研究人員解釋道，2011年NIH臨床中心有18名患者感染腸桿菌，其中就攜帶了包含KPC的質粒。

腸桿菌的碳青霉烯耐藥性也來源于另一種質粒，它包含由NDM1基因編碼的碳青霉烯酶。

在此次分析中，研究人員從NIH臨床中心的近1100名患者身上采集了樣本。這包括直腸、咽喉和/或腹股溝拭子，在2012-2013年期間從醫院的重癥監護室和高危內科病房的患者中采集（每周兩次），以及從其他病房中采集的監控樣本（每月一次），和新入院患者的樣本。

當他們篩查超過14,200個患者樣本及數百個從醫院環境中采集的樣本時，研究小組追蹤到10名患者，攜帶了包含KPC陽性質粒的腸桿菌。還有兩名患者在出院后被檢測出KPC腸桿菌呈陽性。

研究人員之前試圖利用短讀?。?/span>short-read）測序技術對含有KPC的質粒進行測序和追蹤，但遇到了一些問題。Segre解釋道，部分原因在于含有抗性基因的質粒往往含有大的、移動的遺傳元件。

她指出，以這項研究中的碳青霉烯耐藥性質粒為例，KPC基因的兩側伴有Tn4401轉座子，伸出去多達10,000個堿基。因此，在試圖鑒定每個細菌細胞中的多個質粒時就面臨挑戰。為了解決這個問題，研究人員決定利用PacBio的RSII系統來產生單分子的長讀取，這讓他們能夠同時查看細菌基因組的序列和質粒的序列。

利用這種方法，他們對2012-2013年鑒定出的12名KPC陽性患者的分離株進行了測序，同時對2011年爆發期間采集的2個分離株和醫院內的6個環境監控樣本進行了測序。

總的來說，這些序列代表了克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和泛菌屬（Pantoea）的物種，以及大小在9,300和379,000個堿基的質粒，這讓研究團隊能夠鑒定潛在的傳播事件。

研究人員發現，根據共同的遺傳特征，2012-2013年僅有1個病例可與2011年的爆發直接關聯。相反，研究結果表明，許多碳青霉烯耐藥性質粒是在各中心獨立引入的，與早期感染沒有明確的流行病學。讓人意外的是，序列數據還說明耐藥質粒很少發生水平轉移。

研究人員也在嘗試模擬醫院生物膜的情況，以便弄清楚哪些情況可能會促使含KPC的質粒轉移到一個新的微生物宿主。

研究人員還在繼續對新入院的患者以及重癥監護室和其他病房中的患者進行積極監控。

對于目前的研究，每個樣本的測序價格大約是1200美元，但Segre指出，一旦所有質粒的完整參考基因組都產生，還是能夠在高通量的短讀取儀器上開展更經濟的測序。