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蛋白測序 的主要策略是采用化學或者酶消化方法將多肽鏈拆分，然后測定氨基酸殘基含量和組成。本文詳述了蛋白質(zhì)測序的概念，蛋白測序的步驟以及蛋白N-端測序服務(wù)等。

一、概念

當前，所謂蛋白質(zhì)測序 ，主要指的是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的測定。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（Primary structure）包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目。很多場合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用。多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬個不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。

二、測定步驟

1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子 ，必須*行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體;可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈（亞基）.

2 測定蛋白質(zhì)分子 中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。

3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的β-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。

二硫鍵的切割與保護（元素后數(shù)字為下標）

a 過甲酸〔performic acid〕 不可逆

-CH2SO3H

b、還原+氧化 不可逆

[ 巰基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等

-S-CH2-COOH

c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

-R1-S-S-R2 + HSO3-

R1-S- + R2-S-SOH3

可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價力;應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。

巰基（-SH）的保護

作用：這些反應（見下圖）可用于巰基的保護。

4 測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子 比（如下圖）

5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端

多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸（amino-terminal）和C-端氨基酸（Carboxyl-terminal） 。在肽鏈氨基酸順序分析中，zui重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法;Edman法;DNS-Cl;酶降解法），C末端分析法（肼解法;酶降解法;硼氫化鋰法）。

6 多肽鏈斷裂成多個肽段。可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。

7 測定每個肽段的氨基酸順序

8 確定肽段在多肽鏈中的次序。

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。

9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置

一般采用*處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。

三、蛋白質(zhì)N-端測序服務(wù)

幾乎所有的蛋白合成都起始于N-端，蛋白質(zhì)N-端的序列組成對于蛋白質(zhì)整體的生物學功能有著巨大的影響力。例如N-端序列影響蛋白質(zhì)的半衰期，同時關(guān)聯(lián)著蛋白亞細胞器定位等，這些與蛋白的功能和穩(wěn)定息息相關(guān)，對蛋白進行N-端測序分析，有利于幫助分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，揭示蛋白質(zhì)的生物學功能。

目前對蛋白N端測序主要分類兩大類，其一為非質(zhì)譜技術(shù)，例如經(jīng)典的Edman降解法、利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR得到對應蛋白的cDNA，再來反推得到蛋白序列;其二為質(zhì)譜技術(shù)。各自都有其使用的長處和制約之處，目前，市面上采用的，依然是基于經(jīng)典的Edman降解法原理，利用美國ABI公司Procise491蛋白序列測序系統(tǒng)進行蛋白N-端測序。

蛋白質(zhì)N-端測序服務(wù)說明

基于Edman降解法原理進行蛋白質(zhì)N-端測序，從理論上不可避免的受到兩種條件制約，會很大程度上影響蛋白測序質(zhì)量：

1、樣品純度不能太低，經(jīng)驗認為純度大于90%的蛋白才適用于測序反應。

2、N端封閉或糖基化的蛋白質(zhì)難以進行Edman反應，無法測序。

蛋白質(zhì)合成是從N末端開始的，因此分析蛋白質(zhì)合成是從N末端序列對蛋白序列分析很重要，蛋白質(zhì)N端序列主要是通過Edman降解法和質(zhì)樸技術(shù)實現(xiàn)的。