1. 樣品復方*（歐博士*），批號309315 、402021，生產廠家為香港歐化藥業有限公司。

2. 驗證用菌種 枯草桿菌CMCC（B）63501、*CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC （F） 98001、 黑曲霉CMCC（F）98003。

3. 方法 中國藥典有關微生物限度檢查法方法驗證試驗。                       

4. 具體操作方法

    4.1菌液制備：

（1） 取經37℃培養18~24h，*、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養物1ml+9ml鹽水，10倍稀釋至10-5 ~10-7，細菌數約為50~100cfu/ml，做活菌計數備用。

（2） 經25 ℃培養18~24小時的白色念珠菌霉菌液體培養物1ml+9 ml鹽水10倍稀釋至10-5 ~10-7，細菌數約為50~100cfu/ml，做活菌計數備用。

（3） 取經25 ℃培養1周的黑曲霉斜面培養物，加3~5ml鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 用標準比濁管比濁，然后取1 ml +9 ml鹽水，逐管10倍稀釋為10-4，細菌數約為50~100cfu/ml，做活菌計數備用。

4.2 供試液制備 吸取樣品10 ml ，加0.1%蛋白胨水氯化鈉稀釋液90ml濃度均為1：10供試液，分別人工污染上述5種代表試驗菌株。

4.3 培養基稀釋法： 采用加0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供試液，再加15~20 ml瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養24~48小時觀察結果細菌計數，測定回收率。結果見表：

4.4 回收率測定：

（1） 試驗組: 分別取不同品種的1：10供試液1 ml、50~100個/ ml 試驗菌株同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養24~72小時觀察結果。薄膜過濾法以zui后一次的沖洗液加入試驗菌.

（2） 活菌組 測定每一菌株的試驗菌數

（3） 供試液對照 測定供試品本底菌數

（4） 稀釋劑對照組

5 結果

菌落計數結果、常規法和培養基稀釋法在復方*微生物限度檢查法的驗證結果見表1、2和表3。

表1     菌落計數（cfu/ml） 

從表2結果可以看出: （1）采用常規方法檢驗復方*溶液供試品，人工污染5株代表菌株，該供試品對大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗均高于70%，可采用常規方法檢驗。（2）復方*對*、枯草桿菌有不同程度的抗菌活性，供試品回收率為0.02~29.2%，均低于70%。

表2   復方*微生物限度檢查方法驗證 （常規法）  

  表3  培養基稀釋法（1ml加2個平皿）復方*微生物限度檢查驗證

    表3中的結果證明，采用培養基稀釋法可消除供試品對人工污染*和枯草桿菌的抑菌作用。回收率達到70%以上。因此，培養基稀釋法（0.5ml/皿）可用于復方*（歐博士*）的微生物限度檢查。

6 結論

根據驗證試驗結果，確定復方磷可待因（歐博士*）溶液微生物限度檢查法為細菌數測定可采用培養基稀釋法（0.5ml/皿）測定，霉菌數可采用常規法測定。

注：常規法為1ml供試液加15~20ml菌落計數用培養基；培養基稀釋法則為0.5ml供試液加15~20ml菌落計數用培養基為2倍稀釋，0.2ml供試液加15~20ml菌落計數用培養基為5倍稀釋。