在加熱滅菌前，培養基(尤其是瓊脂培養基)的成分應邊攪拌邊溶解于水中。

正如在2.3中所提到的，高壓滅菌的時間取決于培養基中微生物的含量，容器的大 小，每個容器中物質的體積和滅菌鍋內容器的空間。在制備培養基時，由于污染的微生物的含量通常很低，所以影響高壓時間的主要變量取決于上述其他的幾個因素。滅菌時間 通常要在121℃下保持15~20min,這個時間從中心溫度達到121℃開始計算。可以將熱 電偶放人滅菌鍋內部中心進行測定。lOOmL的瓶子或燒杯單獨放在髙壓鍋中達到121℃大約需要10min，如果多個瓶子緊挨著放滿滅菌鍋內的絲懸筐中，瓶子中的物質需要 20min才能達到121℃如果培養基或稀釋液的體積很大時，則需要更長的時間；例如單 獨使用1L的瓶子溫度達到121℃時需要20min,如果許多這樣的瓶子緊挨著放滿滅菌鍋 內的絲懸筐中，則中心溫度要達到121℃需要30mm或更長的時間。很明顯，為了達到滅 菌的目的，對培養基和稀釋液進行高壓滅菌時，惟一正確的方法是將熱電偶放入滅菌鍋中測定。

當培養基分裝在大的容器(1L或更大時）中時，可能會因為延長滅菌加熱時間而造成 熱降解。因此在高壓滅菌前，先將培養基成分溶解后分裝到較小的容器中（如裝入 100ml帶螺帽的淺試劑瓶中)。