DNA

dNTPDAN聚合酶乙醇TE限制性內切核酸酶緩沖液

水浴鍋培養箱

1.  將兩種寡核苷酸各1 μg加入微量離心管中，加水至17 μl，再加2 μl 的10×測序酶緩沖液。70℃加熱5 min，然后在合適的退火溫度下保溫5  min，取2 μl 留待以后的分析。

2.  加2 μl 4種dNTP混合液和10 U測序酶，30℃溫育30 min。

3.  70℃ 10 min 滅活DNA聚合酶，取2 μl 留待以后的分析。

4.  加10×限制性內切酶反應緩沖液，加水和20~100 U 的適合于克隆的限制性內切酶至100 μl。適當的溫度下消化2 h 以上。

5.  酚抽提，加100 μl 4 mol/l 乙酸銨和400 μl 的無水乙醇，-70℃沉淀15 min，離心5 min，沉淀重懸于100 μl TE緩沖液，用乙醇再沉淀一次，用95%乙醇洗滌沉淀，干燥，20 μl TE緩沖液溶解，取2 μl 用于以后的分析。

6.  用篩分型瓊脂糖凝膠電泳分析確證原材料、延伸產物和酶切產物，估計延伸的寡核苷酸的量，再用適當的載體亞克隆。

7.  對幾個合適的亞克隆測序。