組織樣品

液氮PBSGA緩沖液GB緩沖液蛋白酶K無水乙醇蛋白液漂洗液

離心管離心機廢液收集管吸附柱水浴鍋分光光度計低溫冰箱

一、DNA抽提

1.  取新鮮肌肉組織約100 mg，PBS漂洗干凈，置于1.5 ml離心管中，加入液氮，迅速磨碎。
 

2.  加200 μl 緩沖液GA，震蕩至*懸浮。加入20 μl 蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，混勻。
 

3.  加220 μl 緩沖液GB，充分混勻，37℃消化過夜，溶液變清亮。加220 μl 無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。
 

4.  將上述一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB 中，（吸附柱放入廢液收集管中）12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
 

5.  加入500 μl 去蛋白液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
 

6.  加入700 μl 漂洗液GW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm離心30 秒，棄掉廢液。加入500 μl 漂洗液GW，12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。將吸附柱CB 放回廢液收集管中，12 000 rpm 離心2 分鐘，盡量除去漂洗液。
 

7.  將吸附柱CB 轉入一個干凈的離心管中，加入100 μl 洗脫緩沖液（洗脫緩沖液應在60-70℃水浴預熱），混勻，室溫放置15 分鐘，12 000 rpm 離心30 秒。洗脫第二次，將洗脫緩沖液50 μl 加入吸附柱中，室溫放置15 分鐘，12 000 rpm 離心30 秒。
 

8.  采用Beckman DU 640 spectrophotometer 檢測提取到的基因組DNA 濃度，在OD₂₆₀ 處有顯著吸收峰。同時檢測純度，OD2_60/280 的值應為為1.7-1.9。
 

9.  從原液中取出相應體積DNA 溶液，稀釋致50 ng/ul，原液置于-70℃保存，稀釋液置于-20℃保存。
 

二、 PCR擴增目的片段
 

1.  按相關的試劑說明在標準反應管中準備反應體系，典型的PCR反應體系如下（20 ul體系）：
 

2.  向左扳動儀器蓋子上的手柄，揭開儀器蓋子，小心放置樣品管于儀器的相應樣品孔中，輕輕蓋上蓋子，將頂部的旋鈕慢慢旋緊，讓熱蓋緊密接觸樣品管，樣品放置完畢。
 

三、 在T1型PCR儀上編輯一個程序
 

1.  按[C programs]進入編輯模式。要在主目錄中創建一個程序請按[D enter]。要進入一個子目錄，用→鍵將光標向右移動，然后用↑↓鍵選擇一個子目錄。按[D enter]進入選擇的子目錄。
 

2.  輸入程序中要求的溫度：用[D enter]確認溫度。為其輸入時間，用小數點來間隔。順序為h.m.s。用[D enter]確認時間設置，或者用光標鍵移動到下一個區域。＃表示循環的次數。設定循環值=總循環值-1，即，總循環數為30時應輸入“29”。用[C pgm ok]來儲存一個完整的程序。程序數據*的儲存在記憶中。
 

四、運行程序
 

按[B start/stop]選擇一個程序。用→↑↓鍵選擇一個子目錄，或者用[D enter]進入主目錄。輸入您想要啟動的程序的號碼。或者，按[A list]在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個程序。用↑↓鍵在列表中滾動選擇。用[D enter]確認用強光突出的程序。按[D start]啟動程序。
 

五、控制測試過程
 

運行過程中，按A按鈕，可以獲得程序剩余的時間信息。運行完成后，按STOP按鈕終止實驗，按YES確認終止。小心旋開熱蓋，按照放置樣品的操作順序，打開蓋子，取出實驗樣品，再蓋上蓋子，關閉電源，本次實驗結束。
 

六、 PCR產物測序
 

由專門負責測序的服務公司完成。
 

七、數據分析
 

少量可人工讀取，大量可軟件讀取。比對發現的SNP在基因組中的位置：重點是啟動子區、外顯子區域（包括編碼區的cSNP及5’及3’UTR）、剪切邊界等，密碼子的改變是否導致氨基酸的改變：錯義突變、無義突變、終止突變。
 

1.  為保證待測目的區域測序真實可靠，引物設計應該使待測目的區域邊界距離上下游引物至少各50 bp；
 

2.   引物設計建議使用在線方式，以保證成功率；
 

3.  為保證測序敏感性，PCR產物片段大小應在250 bp－650 bp范圍；
 

4.  為方便實驗，建議引物合成時分裝成1 o.d/管，方便將PCR與測序的引物分開；
 

5.  為保證引物的特異性，建議引物設計后在NCBI上blast確認；
 

6.  為防止降解，PCR產物應盡快測序，否則應該保存在-20℃，且時間不宜過長；
 

7.  為保證結果真實性，建議對關鍵點進行反向測序確認。