ELIspot基本操作過(guò)程：
一、包被96孔板：
用70％乙醇浸潤(rùn)96孔板中的PVDF膜30s
加入捕獲抗體（PBS稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜
倒空板中包被液，輕輕在紙上拍干，用PBS洗滌，禁用洗板機(jī)
加入100ul 2%的脫脂奶粉（或者BSA）室溫孵育2小時(shí)，封閉板中空白位點(diǎn)
PBS洗滌1次。
（如果暫時(shí)不用，可將96孔板干燥后4保存，可保存2周以上）
二、細(xì)胞刺激和細(xì)胞因子捕獲
從新鮮血液中用Ficoll分離PBMC并進(jìn)行計(jì)后，將細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋后加入96孔板中。細(xì)胞數(shù)量需要優(yōu)化，進(jìn)行備比稀釋以確定合適的細(xì)胞數(shù)量。通常所用細(xì)胞數(shù)量為1-2×105/孔。
將96孔板在37℃ CO2孵箱中孵育過(guò)夜。禁止移動(dòng)或晃動(dòng)板子。
用含0.1% Tween 20 的PBS孵育10分鐘，去除細(xì)胞和未結(jié)合的細(xì)胞因子。然后用含0.1% Tween 20 的PBS洗滌3次。 禁用洗板機(jī)。
三、加入檢測(cè)抗體檢測(cè)
加入標(biāo)記的檢測(cè)抗體（用含1％BSA的PBS稀釋?zhuān)覝胤跤?-2小時(shí)。
加入底物顯色（如果檢測(cè)抗體為酶標(biāo)）或者熒光直接檢測(cè)（如果檢測(cè)抗體是熒光標(biāo)記）：在加入底物之前用蒸餾水洗滌板子膜的兩側(cè)，以防止部分溶液漏出后導(dǎo)致的背景。監(jiān)測(cè)斑點(diǎn)的形成，適時(shí)終止反應(yīng)
用蒸餾水洗滌終止反應(yīng)
四、結(jié)果分析
將96孔板干燥。（將板子放在4℃避光過(guò)夜，可使斑點(diǎn)邊緣銳化，更易分辨）
使用讀板儀進(jìn)行結(jié)果分析
ELISpot實(shí)驗(yàn)需要的試劑：
PVDF包被的96孔板 包被抗體 標(biāo)記的檢測(cè)抗體（酶、Biotin、熒光） AP/HRP－鏈霉親和素（如果檢測(cè)抗體是Biotin標(biāo)記） 底物溶液 各種緩沖液：包被液、稀釋液、洗滌液等 陽(yáng)性對(duì)照：重組的細(xì)胞因子或者已知產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞 96孔板- 硝基纖維素底板、PVDF-底的免疫斑點(diǎn)板或者平底的酶標(biāo)板 ELISpot技術(shù)要點(diǎn) ：
1. 操作BCIP/NBT顯色液時(shí)戴上手套。
2. 為了防止邊緣影響，在96孔扳外面包裹錫箔膜，包裹直到顯色結(jié)束再棄去。
3. 加樣細(xì)胞和試劑時(shí)加樣槍頭千萬(wàn)不能碰觸孔底的PVDF膜，以防止損壞PVDF膜。
4. 常用的96孔扳雖然不是無(wú)菌的，但是短暫的孵育時(shí)間和培養(yǎng)液中抗生素的存在，ELISpot的操作過(guò)程不會(huì)有污染的麻煩。
5. 絕大部分板子只能一次做完，請(qǐng)務(wù)必在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)方案，盡量zui大程度地利用板孔和試劑。
6. 檢測(cè)抗體和酶現(xiàn)配現(xiàn)用。
7. 為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議作雙復(fù)孔或三復(fù)孔。
8. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，不要在高于37℃的溫度下干燥，否則PVDF膜可能會(huì)破裂。
9. 以下對(duì)照設(shè)定：
陽(yáng)性對(duì)照：重組細(xì)胞因子或確定能分泌該種細(xì)胞因子的細(xì)胞 陰性對(duì)照：相同數(shù)量的未刺激細(xì)胞 背景對(duì)照：無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)液 檢測(cè)抗體對(duì)照：用PBS代替檢測(cè)抗體 ELISpot技術(shù)介紹：
從單細(xì)胞水平觀(guān)察分泌蛋白的表達(dá)已成為目前研究細(xì)胞功能的重要內(nèi)容，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISpot）技術(shù)巧妙地運(yùn)用了酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，從方法上解決了該難題，已廣泛運(yùn)用于各項(xiàng)重要課題研究中。ELISpotzui初用于檢測(cè)分泌抗原特異性抗體的個(gè)體B細(xì)胞，以后該方法不斷改進(jìn)，用于檢測(cè)分泌特定抗原的單個(gè)細(xì)胞。
相比較于流式細(xì)胞儀、免疫組化、原位雜交等其它在單細(xì)胞水平檢測(cè)蛋白分泌能力的方法，ELISpot方法更為簡(jiǎn)單和穩(wěn)定，同時(shí)具有更高的靈敏度。 ELISpot方法操作簡(jiǎn)便，但卻能提供非常類(lèi)似于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境。在單細(xì)胞水平進(jìn)行特定抗原的監(jiān)控，可以模擬體內(nèi)環(huán)境，跟蹤細(xì)胞因子的產(chǎn)生，是檢測(cè)細(xì)胞功能的*手段。現(xiàn)已被廣泛運(yùn)用于世界各大實(shí)驗(yàn)室的疾病診斷和科學(xué)研究活動(dòng)之中。
