1. 探針的標(biāo)記：

（1） 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：待標(biāo)記探針 （1.75pmol/微升） 2微升T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升Nuclease-Free Water 5微升[γ-32P]ATP（3，000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升T4 Polynucleotide Kinase （5-10u/微升） 1微升總體積 10微升

按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。

（2） 使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。

（3） 加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。

（4） 再加入89微升TE，混勻。此時可以取少量探針用于檢測標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡便起見，通常不必測定探針的標(biāo)記效率。

（5） 標(biāo)記好的探針立即使用，zui長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。

2. 探針的純化：

通常為實(shí)驗(yàn)簡便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：

（1） 對于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。

（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時，或在-20℃沉淀過夜。

（3） 在4℃，12, 000g-16, 000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。

（4） 在4℃，12, 000g-16, 000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。

（5） 加入100微升TE，*溶解沉淀。標(biāo)記好的探針立即使用，zui長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在 -20℃。

3. EMSA 膠的配制：

（1） 準(zhǔn)備好倒膠的模具。可以使用常規(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞摺＿x擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。

（2） 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠（注意：使用29：1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大）。TBE buffer （10X） 1毫升重蒸水 16.2毫升39：1 acrylamide/bisacrylamide （40%，w/v） 2毫升80% 甘 625微升10% 過硫酸銨 （ammonium persulfate） 150微升TEMED 10微升

（3） 按照上述次序加入各個溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡， 并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。

4. EMSA結(jié)合反應(yīng)：

（1） 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)（預(yù)期的結(jié)果參見圖1）：

（2） 按照上述順序依次加入各種試劑,在加入標(biāo)記好的探針前先混勻,并且室溫（20-25℃）放置10分鐘,從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合,或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng).然后加入標(biāo)記好的探針,混勻,室溫（20-25℃）放置20分鐘.

（3）加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（無色,10X）,混勻后立即上樣.注意：有些時候溴酚藍(lán)會影響蛋白和DNA的結(jié)合,建議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液.如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣,可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液,至能觀察到藍(lán)顏色即可.

5. 電泳分析：EMSA的典型分析結(jié)果可以參見下面的圖1.

圖1. 一個典型的EMSA/Gel-Shift分析圖

1,陰性對照反應(yīng)（標(biāo)記探針）;2,常規(guī)反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針）;3,探針冷競爭反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針+標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記探針）;4,突變探針的冷競爭反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針+標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記突變探針）;5,Super-shift反應(yīng)（含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針+目的轉(zhuǎn)錄因子的特異抗體）.

（1） 用0.5XTBE作為電泳液.按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘.預(yù)電泳的時候如果有空余的上樣孔,可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液（藍(lán)色）,以觀察電壓是否正常進(jìn)行.

（2） 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi).在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 （藍(lán)色）,用于觀察電泳進(jìn)行的情況.

（3） 按照10V/厘米的電壓電泳.確保膠的溫度不超過30℃,如果溫度升高,需要適當(dāng)降低電壓.電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處,停止電泳.

（4） 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙.小心取下夾有EMSA膠的膠板,用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液.小心打開兩塊膠板中的上面一塊（注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板）,把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個EMSA膠,輕輕把濾紙和膠壓緊.濾紙被膠微微浸濕后（大約不足1分鐘）,輕輕揭起濾紙,這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來.把濾紙側(cè)向下,放平,在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜,確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡.

（5） 干膠儀器上干燥EMSA膠.然后用X光片壓片檢測,或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測.