1、一般培養(yǎng)：保持胚胎干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)
培養(yǎng)基細(xì)胞復(fù)蘇凍存細(xì)胞明膠包被細(xì)胞傳代
2 、體外分化
培養(yǎng)基包被有多聚/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）
體外分化方法
注：以下培養(yǎng)針對(duì)于小鼠的R1胚胎干細(xì)胞系，其它胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)可以參考。不過人的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)不可以采用下面的protocol，需要用的protocol和培養(yǎng)基。
一般培養(yǎng)
維持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)
ES細(xì)胞培養(yǎng)用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed細(xì)胞的培養(yǎng)基（高糖）來阻止細(xì)胞的分化。為細(xì)胞提供包被有0.1%明膠的平板作為粘附細(xì)胞的基質(zhì)。建議每2-3天從達(dá)到80%-90%融合的平板按1：8的比率傳代細(xì)胞一次，細(xì)胞傳代以后，在將細(xì)胞接種在0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預(yù)先將細(xì)胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個(gè)小時(shí)，使分化細(xì)胞粘附，從而將分化和未分化細(xì)胞分開。將細(xì)胞全程置于37℃，5%CO2，濕度條件下培養(yǎng)。如果在Feed細(xì)胞，那么就需要采用MMC進(jìn)行處理，抑制Feed細(xì)胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暫不提及Feed細(xì)胞。Feed細(xì)胞可以來源于STO細(xì)胞或原代胚胎成纖維細(xì)胞。
培養(yǎng)基
ES：
配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文）。分裝在50ml 離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養(yǎng)基，0.22 μm濾膜過濾。貯存于4℃，時(shí)間不要超過2周。貯存液DMEM（高糖）馬血清（HS）L-（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巰基乙醇（55Mm）PESTLIF
復(fù)蘇細(xì)胞
細(xì)胞被凍存在10%二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會(huì)損害細(xì)胞。然而，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞有毒性，快速的進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇是很重要的。
步驟：1、從液氮中取出一管細(xì)胞;2、將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好*溶解）;3、將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中;4、加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）;5、離心3分鐘;6、棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，至少吹打10次;7、接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿;8、孵育。
凍存細(xì)胞
凍存液：90%HS和10%DMSO
步驟：1、1×PBS洗細(xì)胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi);2、用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞;3、將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml 離心管管內(nèi)并離心3分鐘;4、棄去上清并將細(xì)胞重懸于冷的凍存液中（10 cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用6-7ml。）5、分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml;6、置-80℃過夜，第二天移入液氮。
Geltin（明膠）包被
準(zhǔn)備500ml 0.1%geltin溶液1、將0.5 g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中（50-65℃水浴15～30分鐘）。2、在溶液沒有冷卻的情況下通過0.22 μm濾膜過濾，貯存在4℃。
包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿1、加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面（15 cm培養(yǎng)皿加2ml，10 cm培養(yǎng)皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能*覆蓋培養(yǎng)表面就行了。）;2、置室溫30分鐘;3、去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，將板子平放或倒扣，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。
細(xì)胞傳代
建議每2天傳代細(xì)胞一次，過度生長(zhǎng)的細(xì)胞會(huì)降低細(xì)胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來去除分化細(xì)胞，在將細(xì)胞接種在明膠包被的培養(yǎng)板上之前，通過將分化細(xì)胞黏附在沒有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細(xì)胞。純化步驟包含在下面的方法中。
1、去除培養(yǎng)液;2、無鈣鎂PBS（Gibco）洗滌;3、加入EDTA（Gibco）。37℃孵育5分鐘。4、加入ES。培養(yǎng)基使失活;5、將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15 ml離心管中離心3min;6、去除上清，將細(xì)胞重懸于2 ml ES培養(yǎng)基，至少吹打10-20次。如果加入培養(yǎng)基的量較少會(huì)比較容易將細(xì)胞團(tuán)弄散分開。ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向，傳代過程中仔細(xì)將細(xì)胞弄散分開很重要。這樣可能會(huì)減少細(xì)胞的自然分化。7、將細(xì)胞接種在沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（使用和一開始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿）放入溫箱2小時(shí)（分化細(xì)胞在該時(shí)間內(nèi)將黏附，而ES細(xì)胞仍將保持懸浮）;8、將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入geltin包被的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細(xì)胞被分散開（前面已經(jīng)提到--ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向）9、建議按1：4-1：10的比率傳代 （ATCC）
保持細(xì)胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗(yàn)，1：8的比率是好的，可以使細(xì)胞的自然分化降到zui低。當(dāng)你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞傳代可以使用表1來計(jì)算傳代比率。
