蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的、等芳香族氨基酸。它們具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內(nèi)吸收峰的光密度值與其濃度成正比關系，故可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)，但由于各種蛋白質(zhì)的和的含量不同，故要準確定量，必需要有待測蛋白質(zhì)的純品作為標準來比較，或且已經(jīng)知道其消光系數(shù)作為參考。另外，不少雜質(zhì)在280nm波長下也有—定吸收能力，可能發(fā)生干擾。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶堿)的影響更為嚴重。然而核酸的zui大吸收峰是在260nm。因此溶液中同時存在核酸時，必須同時測定OD₂₆₀nm，與OD₂₈₀nm。，然后根據(jù)兩種波長的吸收度的比值，通過經(jīng)驗公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實含量。

本法操作簡便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，多用于純化之蛋白質(zhì)的微量測定。主要缺點：當待測的蛋白質(zhì)與標準蛋白質(zhì)中的和含量差異較大時，則產(chǎn)生—定誤差，混有核酸時必須分別測定280nm和260nm兩處的OD值，再按公式推算蛋白質(zhì)含量。

[操作]

取試管7支,各管混勻，盛于石英杯中，用紫外分光光度計，以空白管調(diào)節(jié)零點，分別于280nm、260nm波長下測定各管光密度。

[計算]

(一)直接根據(jù)標準液與待測液的光密度值(OD₂₈₀nm)，或從標準曲線，求得樣本蛋白質(zhì)含量。

以標準管各管光密度值為縱坐標，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標繪制標準曲線，然后根據(jù)測定管光密度值，直接查標準曲線求得樣本中蛋白質(zhì)的含量。

1． 選一種與待測樣本蛋白質(zhì)氨基酸組成相近似的蛋白質(zhì)純品，用生理鹽水稀釋至濃度為lmg/m1，作為稀釋標準蛋白質(zhì)溶液。

2．用生理鹽水稀釋待測樣本蛋白質(zhì)至濃度約為lmg/m1，即為稀釋樣本蛋白質(zhì)溶液。

(二)利用經(jīng)驗公式直接計算樣本蛋白質(zhì)含量，

準確吸取血清樣本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度，即500倍稀釋，在280nm和260nm兩處波長分別測得光密度值、再按下列公式計算。

1、OD₂₈₀/OD₂₆₀＜1.5時，用Lowry-Kalokar公式：

樣本蛋白質(zhì)含量(mg/m1)＝1.45OD₂₈₀一0.74OD₂₆₀

2、OD₂₈₀/OD₂₆₀﹥1.5時，用Lamber-Beer定律計算：

樣本蛋白質(zhì)含量(mg/m1)= OD₂₈₀/K×L＝（OD₂₈₀/6.3×1）×10g/L

本實驗樣品：牛血清白蛋白E1%cm＝6.3（100ml/cm.g）

K：克分子消光系數(shù)；E1%cm：百分比吸光度的吸光系數(shù)；

注：不同蛋白質(zhì)中的和含量有差異，故標準管與測定管的蛋白質(zhì)氨基酸組成應相似，以減小誤差。

[器材]

(一)UV-9200紫外分光光度計

(二)50ml容量瓶

[試劑]

(一)生理鹽水

(二)清蛋白(人或牛)純晶

(三)待測樣本蛋白質(zhì)：用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的樣品用生理鹽水稀釋而成。