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士鋒Taq DNA聚合酶介紹

時間:2015/8/11閱讀:653
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(一)酶活性與熱穩定性

該酶基因全長2496個堿基,編碼832個氨基酸,酶蛋白分子為 94KDa.其比活性為200000單位/mg.75~80℃時每個酶分子每秒鐘可延伸約150個核苷 酸,70℃延伸率大于60個核苷酸/秒,55℃時為24個核苷酸/秒.溫度過高(90℃以上) 或過低(22℃)都可影響Taq DNA聚合酶的活性,該酶雖然在90℃以上幾乎無DNA合成, 但確有良好的熱穩定性,在PCR循環的高溫條件下仍能保持較高的活性.在92.5℃、95℃ 、97.5℃時,PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經130min,40min和5~6min后,仍可 保持50%的活性,實驗表明.pcr反應時變性溫度為95℃~20sec,50個循環后,Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的熱穩定性是該酶用于PCR反應的前提條 件,也是PCR反應能迅速發展和廣泛應用的原因.Taq DNA聚合酶還具有逆轉錄活性, 其作用于類似逆轉錄酶.此活性溫度一般為65~68℃,有Mn2+存在時,其逆轉錄活性 更高.

(二)離子依賴性

aqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶,該酶的催化活性對Mg2+濃度非常敏感.以活性程度 很低的鮭魚精子DNA為模板,dNTP的濃度為0.7~0.8mmol/L時,用不同濃度Mg2+進行 PCR反應10min,測定結果為Mgcl2濃度在2.0mmol/L時該酶催化活性zui高,此濃度能zui 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性,Mg2+過高就抑制酶活性,當Mgcl2濃度在 10mmol/L時可抑制40~50%的酶活性.由于Mg2+能與dNTP結合而影響PCR反應液中游離 的Mg2+濃度,因而Mgcl2的濃度在不同的反應體系中應適當調整,優化濃度.一般反應 中Mg2+濃度至少應比dNTP總濃度高0.5~1.0mmol/L.適當濃度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50~60%,其zui適濃度為50mmol/L,高于75mmol/L時明顯抑制該酶 的活性.

(三)忠實性

taqDNA聚合酶具有5"→3"聚合酶活性和5"→3"外切酶活性,而無3"→5"外切活 性,它不具有Klenow酶的3"→5"校對活性.因而,在PCR反應中如發生某些堿基的錯 配,該酶是沒有校正功能的.Taq DNA聚合酶的堿基錯配機率為2.1×10-4.

(四)抑制劑

低濃度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSD)對Taq DNA聚合酶的 催化活性并無影響.極低濃度的離子表面活性劑如脫氧膽胺酸鈉(小于0.06%),十二烷 基肌氨酸鈉(小于0.02%),十二烷基硫酸鈉(SDS,小于0.01%)幾乎可*抑制該酶的 活性.而非離子表面活性劑在較高濃度(Tween20,NP-40.和Tritox-100)如>5%時方能 抑制該酶的活性.

變性劑對TaqDNA聚合酶活性的影響

變性劑濃度 活性(%)乙醇≤3%100 10%110尿素≤0.5mol/L100 1.0mol/L118 1.5mol/L107 2.0mol/L82DMSO≤1%100 10%53 20%11DMF≤5%100 10%82 20%17甲酰胺≤1%100 15%86 20%39SDS0.001%105 0.01%10 0.1%<0.1
低濃度的NP-40(0.05%)和Tween20(0.05%)能增強TaqDNA聚合酶的活性.低濃度SDS對 該酶的抑制作用可加入一定濃度的NP-40和Tween20抵消.TaqDNA聚合酶可在-20℃貯 存至少6個月.

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