目的
對于許多重組DNA的實驗，知道DNA的序列常是進(jìn)一步操作所*的。 本實驗將定出你所選殖之cDNA的序列，并進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對分析。其目的在教導(dǎo)學(xué)生如何從事DNA定序分析及DNA序列的計算機分析。
原理
本實驗所使用之方法為F. Sanger所發(fā)展之dideoxy定序法。 此法乃是將一引子黏合到欲定序之DNA模板上，再利用DNA聚合脢行聚合反應(yīng)，直到加入一dideoxyribonucleoside triphosphate (ddNTP)而中斷。 每一定序分析須執(zhí)行四組反應(yīng)，每一反應(yīng)含有所有四種deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP)及*之一種ddNTP。 由于ddNTP缺少核酸鏈聚合所需之3’-OH基，四組反應(yīng)中的核酸鏈將會分別停在A、 G、 C或T。 dNTP和ddNTP的相對濃度可調(diào)整至所產(chǎn)生中斷鏈的長度范圍從數(shù)十到數(shù)百個核甘酸。然后，利用高解析力之定序膠體電泳將四組反應(yīng)產(chǎn)生之dna片段依長度大小分開，即可讀出DNA序列。
材料
• RNAse A：10 mg/ml水溶液。
• 30% polyethylene glycol (PEG) 6000/1.5 M NaCl
• 2 M NaOH/2 mM EDTA
• 3M sodium Acetate (pH 5.3)
• 下列試劑來自United States Biochemical公司所售之Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit：
o Sequenase Reaction Buffer (5X concentrate)：200 mM Tris-HCl (pH 7.5)，100 mM MgCl2，250 mM NaCl
o pUC/M13 forward (-47) primer： 5"-d(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)-3"
o 四種Termination Mix： 均含50 mM NaCl，80 ?M dATP，80 ?M dGTP，80 ?M dCTP，80 ?M dTTP，并各含8 ?M ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP
o 0.1 M dithiothreitol(DTT)
o Labeling Mix (5X concentrate)： 7.5 ?M dGTP，7.5 ?M dCTP，7.5 ?M dTTP
o Enzyme Dilution Buffer：10 mM Tris-HCl (pH 7.5)，5 mM DTT，0.5 mg/ml BSA
o Sequenase Version 2.0 T7 DNA polymerase：13 units/?l in 20 mM KPO4 (pH7.4)，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% glycerol
o Stop Solution： 95% formamide，20 mM EDTA，0.05% bromophenol blue，0.05% xylene cyanol FF
• 10 mCi/ml [35S]dATP：購自Amersham公司
• 40% acrylamide/bis-acrylamide(19:1)溶液
• urea
• 10X TBE buffer：890 Mm Tris-borate，890 mM boric acid，20 mM EDTA
• 10% ammonium persulfate
• TEMED (N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine)
