13127537090
當前位置：上海士鋒生物科技有限公司>>技術文章>>Sanger酶法DNA序列分析
一、試劑
1 、 10 × TBE ( pH 8.3 )：
2 、 46% 尿素溶液：
3 、 20% 聚丙烯酰胺溶液
4 、 10% 過硫酸胺
5 、引物
6 、模板
7 、 DNA 聚合酶
8 、放射性標記的 dNTP 和 ddNTP 貯存液
9、TEMED
二、操作方法
(一)由雙鏈質粒制備單鏈DNA膜板
取質粒 DNA (溶于雙離蒸去離子水中) 8μl ( 1.5 ～ 2ug )
↓
加 2mol NaOH 2ul ，混勻后稍加離心，置室溫 10min
↓
加 3mol 乙酸鈉( pH5.2 ) 3μl
雙蒸去離子水 7μl
無水乙醇 60μl
↓
置液氮 10min ，離心 10min ( 13krpm )，
↓
加 70%乙醇洗1次，離心 ( 13krpm )
↓
棄上清，真空抽干，溶于 10ul雙 蒸去離子水中
↓
取樣，電泳鑒定
(二)聚丙烯酰胺/尿素膠制備：
將玻板洗凈，拭干; 70% 乙醇洗，涼干;內層涂硅油，
重蒸水洗凈，吹干
↓
混合： 20% 聚丙烯酰胺液 20ml
10 × TBE 5ml
46%尿素 25ml
總計40ml過濾紙濾過
↓
加 10%過硫酸胺(AP)250μl;用雙蒸去離子水定容至100ml，混勻
↓
倒膠前加入 TEMED 50μl，混勻
↓
灌膠，待凝膠聚合后，將測序膠板安裝于測序電泳槽中
↓
電泳槽中加入 800ml1 × TBE
↓
預電泳
(三)DNA序列反應：
模板 DNA 10μl ; 4 只離心管上標記
引物 2μl G 、 A 、 T 、 G 各管中
退火緩沖液 2μl 分別加入 2.5ul 的 ddNTP
總體積 14μl 終止混合液，蓋好蓋子。
↓ ↓
60℃ 10min 變性 37℃孵育1min
↓ ↓
標記混合物 3μl
α-32P-dATP 1μl
稀釋的DNA聚合酶2μl
↓
混勻后置室溫5min
↓
每個反應管4.5μl ↓
↓--------------------------------
37℃ 5min溫浴
↓
每管加入5μl 終止液
↓
混勻，置冰上
↓
上樣前75～80℃
↓
混勻，置冰上
↓
上樣前75℃～85℃加熱2min，隨即上樣
↓
依次為A、G、C、T，每孔上樣2～3μl
↓
40W恒功率下電泳，至溴酚藍走到底
↓
請輸入賬號
請輸入密碼
請輸驗證碼
以上信息由企業自行提供，信息內容的真實性、準確性和合法性由相關企業負責，環保在線對此不承擔任何保證責任。
溫馨提示：為規避購買風險，建議您在購買產品前務必確認供應商資質及產品質量。
