Institute of Orthopedic Oncology, Fourth Military Medical University, Xi"an 710038, China 摘 要 電穿孔技術利用電場造成細胞膜的改變從而將DNA導入細胞內，同時還可用于細胞融合以及動物克隆等。基因電轉移的效率通常比化學法提高1-2個數量級，主要與脈沖波形、長度、緩沖液等有關。方波直流電脈沖應用廣泛，在有關細胞核移植的多項研究報告中均指出其重要作用。關鍵詞 基因轉移，胚胎克隆，電穿孔

過去十年中，關于基因功能的研究取得了豐碩的成果，并因此帶動了基因工程、基因治療以及單克隆抗體技術的進步，而在動物生殖生物學領域的革命性技術進步則導致了綿羊、牛、猴子和小鼠等多種動物的克隆成功。電穿孔技術和儀器的發展在這些成就中扮演了重要角色，使得人類不但能從胚胎細胞克隆動物，甚至能從*分化的成熟細胞獲得克隆動物。全新的基因操作和生殖技術將為21世紀帶來重要的科學成就。電穿孔技術是利用脈沖電場改變細胞膜的狀態和通透性，達到將DNA導入細胞以及促使細胞發生融合的目的。該技術目前一方面應用于細菌、真菌、植物、昆蟲和哺乳動物細胞的基因轉移，另一方面應用于細胞融合制備雜交細胞和動物克隆等。

1、 在基因轉移和雜交瘤中的應用

1.1 動物和昆蟲細胞轉染電穿孔技術在80年代初期開始用來將DNA導入多種動物細胞[1]，較之傳統的磷酸鈣和脂質體轉染，電穿孔具有操作簡便、轉染效率高等諸多優點，特別是對那些其它方法難以奏效的細胞具有明顯優勢，但它的影響因素也比較多。電場強度：電壓太低時，細胞膜的改變不足以允許DNA分子通過，而電壓過高時又會造成細胞的不可逆損害。對于大多數哺乳動物細胞細胞而言，250-2500V/cm的電壓可獲得有效轉染[2,3]。電脈沖形狀和長度：電脈沖形狀主要有指數衰減式和方波兩種，大多歷時20-100毫秒。緩沖液：通常使用和蔗糖等非離子緩沖液，但有報道認為HEPES緩沖液的轉染效率更高，血清也可以提高轉染效率[4]。其它諸如轉染溫度，DNA濃度和構象等均會對轉染效果產生影響。

1.2 大腸桿菌和酵母的轉化電穿孔法在80年代末開始被用于轉化大腸桿菌[5]，由于細菌相對較小，因此與DNA導入動物細胞相比，大腸桿菌通常要求4000-20000V/cm的脈沖強度才能獲得有效轉染。化學法感受態細胞的轉染效率zui高只能達到每微克DNA 106-108個轉化體，而電穿孔法卻可以達到109-1010個轉化體的水平，較前者提高10-100倍，因此在制備cdna文庫等要求較高轉化率的工作中就顯得十分關鍵。 酵母菌電轉化克服了乙酸鋰和原生質體法煩瑣和轉化率低的不足，效率明顯提高[6]。

1.3 細胞融合制備雜交瘤 細胞融合主要用于產生雜交瘤細胞[7,8]。在單克隆抗體的制備過程中，傳統用PEG融合法產生雜交瘤細胞，這在現代化生產中存在許多局限性。而電融合法制備雜交瘤可以大規模地批量、融合，縮短了整個生產周期。除此以外，在細胞生物學研究中電融合還被廣泛應用于其它雜交細胞的制備[9]。

2、胚胎工程的核移植和活化 在從簡單的胚胎干細胞轉染到核移植胚胎的電活化中，電穿孔技術都發揮了關鍵的作用，下面是一些重要的應用。

2.1 單性生殖、四倍體及嵌合體

2.1.1 單性生殖中的電活化 反復的直流方波脈沖可以激活卵母細胞使其發生分裂而產生單倍體胚胎。可以通過細胞松弛素B抑制第二極體或通過電融合來獲得二倍體細胞。

2.1.2四倍體胚胎的制備 在胚胎的兩細胞階段應用直流脈沖可以導致細胞融合產生四倍體胚胎。這在小鼠和豬、牛都得到了應用[10]。

2.1.3 胚胎干細胞嵌合體的制備 通過胚胎干細胞的電轉染可以制備嵌合體轉基因小鼠。將干細胞注入受體的胚泡，然后將這個胚泡轉入代理母親子宮。出生的后代之間互相雜交產生純合子可供用于生殖研究。已經制備了如小鼠、豬、兔和鳉的胚胎干細胞嵌合體[11]。