一、細胞冷凍保存

1.材料：

生長良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO（Sigma D-2650）、無菌塑料冷凍保存管（Nalgene 5000-0020）、0.4%（w/v）trypan blue（GibcoBRL15250-061）、血球計數盤與蓋玻片、等速降溫機（KRYO10SeriesII）

2、冷凍保存方法：

（1）傳統方法: 冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16～18小時（或隔）--->液氮槽vaporphase儲存。

-20℃不可超過1小時，以防止胞內冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2）程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

3、步驟：

（1）冷凍前24-48小時更換半量或全量培養基，使細胞處于指數生。

（2）配制冷凍保存溶液（使用前配制）：另取一離心管，加入培養基、血清，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。

（3）離心收集培養之細胞，用加血清的培養基重懸起細胞，取少量細胞懸浮液（約0.1ml）計數細胞濃度及凍前存活率。

（4）取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動試管，制成細胞凍存懸液（DMSOzui后濃度為5～10%），使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1～2ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數、日期。然后進行凍存。

4、注意事項：

（1）欲冷凍保存之細胞應在生長良好（logphase）且存活率高之狀態，約為80～90%致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。

（2）細胞在液氮中可凍存無*，而不會影響細胞活力;在-70度可保存數月。

（3）注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色（以0.22micron　FGLP　flon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650），以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因儲存后對細胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲，可降低細胞受損。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化，可換用10%甘you凍存。

（4）冷凍保存之細胞濃度：

①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml

②hybridoma:1～3×106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。

③adherent tumor lines:5～7×106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml

④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。

（5）冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。

（6）凍存可用10%～90%的血清，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細胞懸浮而少沉積（4度時），復蘇存活率在80%～90%以上，對原代培養細胞，以90%血清凍存更為有效。

二、冷凍細胞活化

1、冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。

2、細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常（例如產生單株抗體或是其它蛋白質）。

3、材料

37℃恒溫水槽、新鮮培養基、無菌吸管/離心管/培養瓶、液氮或干冰容器

4、步驟：

（1）操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

（2）自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。

（3）將新鮮培養基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。

（4）取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。

（5）取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內（稀釋比例為1:10～1:15），混合均勻，放入CO2培養箱培養。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試。

（6）解凍后是否立即去除冷凍保護劑（例如DMSO或glycerol），依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養基之離心管內，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入CO2培養箱培養。

（7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養后隔日更換培養基。

三、細胞計數與存活測試

1、原理：

（1）計算細胞數目可用血球計數盤或是Coultercounter粒子計數器自動計數。

（2）血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每ml中之細胞數目。

（3）存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計算細胞活率：活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×。計數應在臺盼蘭染色后數分鐘內完成，隨時間延長，部分活細胞也開始攝取染料;因為臺盼蘭對蛋白質有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數更為準確。

2、材料：

0.4%w/v trypan blue（GibcoBRL15250-061）;Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish（SigmaE-9259）及0.05gram preservative methyl paraben（SigmaH-3647）溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計數盤及蓋玻片（Hemocytometerandcoverslip）;計數器（counter）;低倍倒立顯微鏡;粒子計數器（Coultercounter,CoulterElectronics）。白細胞稀釋液（4%乙酸溶液）。

3、步驟：

（1）取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue（orErythrosinbluish）等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。

（2）取少許混合液（約15μl）自血球計數盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色（或紅色-Erythrosin bluish）。

（3）計數四個大方格之細胞總數，再除4，乘以稀釋倍數（至少乘以2，因與trypanblue等體積混合），zui后乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞（或計下線與左線之細胞）。

注：4大格細胞總數×稀釋倍數×104/4=細胞數/ml;每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml

計數板計數時，zui適濃度為5～10×105細胞/ml，此范圍外計數誤差偏大。高濃度細胞懸液，可取出部分作稀釋或連續稀釋后計數。

5、范例：

T75 monolayer culture制成10ml細胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數盤，計數四大方格內之細胞數目。

活細胞數/方格：55，62，49，59;死細胞數/方格：5，3，4，6;細胞總數=243

平均細胞數/方格=60.75;稀釋倍數=2;

細胞數/ml：60.75×104×2（稀釋倍數）=1.22×106;

細胞數/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106

存活率：225/243﹦92.6%

細胞凍存、解凍方法與細胞計數

一、細胞冷凍保存

1、材料：

生長良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO（Sigma D-2650）、無菌塑料冷凍保存管（Nalgene　5000-0020）、0.4%（w/v）trypan blue（GibcoBRL15250-061）、血球計數盤與蓋玻片、等速降溫機（KRYO10SeriesII）。

2、冷凍保存方法：

（1）傳統方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時（或隔）→液氮槽vaporphase儲存。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2）程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

3、步驟：

（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。

（2）配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養基中，zui后濃度為5～10%，混合均勻，置于室溫下待用。

（3）依細胞繼代培養之操作，收集培養之細胞，取少量細胞懸浮液（約0.1ml）計數細胞濃度及凍前存活率。

（4）離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。

4、注意事項：

（1）欲冷凍保存之細胞應在生長良好（logphase）且存活率高之狀態，約為80–90%致密度。

（2）冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。

（3）注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色（以0.22micron　FGLP　flon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650），以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因儲存后對細胞會有毒性。

（4）冷凍保存之細胞濃度：

①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml

②hybridoma：1～3×106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。

③adherent tumor lines：5～7×106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml

④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。

（5）冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。

二、冷凍細胞活化

1、冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。

2、細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常（例如產生單株抗體或是其它蛋白質）。

3、材料 ：37℃恒溫水槽、新鮮培養基、無菌吸管/離心管/培養瓶、液氮或干冰容器 。

4、步驟：

（1）操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

（2）自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。

（3）將新鮮培養基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。

（4）取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。

（5）取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內（稀釋比例為1：10～1：15），混合均勻，放入CO2培養箱培養。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試。

（6）解凍后是否立即去除冷凍保護劑（例如DMSO或glycerol），依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養基之離心管內，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入CO2培養箱培養。

（7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養后隔日更換培養基。

三、細胞計數與存活測試

1、原理：

（1）計算細胞數目可用血球計數盤或是Coultercounter粒子計數器自動計數。

（2）血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每ml中之細胞數目。

（3）存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。

2、材料：

0.4%w/v trypan blue（GibcoBRL15250-061）;Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish（SigmaE-9259）及0.05gram preservative methyl paraben（SigmaH-3647）溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計數盤及蓋玻片（Hemocytometerandcoverslip）;計數器（counter）;低倍倒立顯微鏡;粒子計數器（Coultercounter,CoulterElectronics）。

3、步驟：

（1）取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue（orErythrosinbluish）等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。

（2）取少許混合液（約15μl）自血球計數盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色（或紅色-Erythrosin bluish）。

（3）計數四個大方格之細胞總數，再除4，乘以稀釋倍數（至少乘以2，因與trypanblue等體積混合），zui后乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞（或計下線與左線之細胞）。

注：4大格細胞總數×稀釋倍數×104/4=細胞數/ml;每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml

4、范例：

T75 monolayer culture制成10ml細胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數盤，計數四大方格內之細胞數目。

活細胞數/方格：55，62，49，59;死細胞數/方格：5，3，4，6;細胞總數=243

平均細胞數/方格=60.75;稀釋倍數=2

細胞數/ml：60.75×104×2（稀釋倍數）=1.22×106

細胞數/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106

存活率：225/243﹦92.6%