士鋒生物雜交瘤細胞的詳細介紹和制備過程

時間：2013-11-28閱讀：811

1）瘤細胞培養(yǎng)（無特殊要求）
骨髓瘤細胞呈懸浮或輕微附著形式生長，如附著性生長的細胞多時，用吸管輕輕吹打或輕輕叩擊培養(yǎng)容器即可分離下來。通常要維持細胞于指數(shù)生（細胞培養(yǎng)時間為15~20小時），每3~5天取細胞0.2~1ml移入到10ml新培養(yǎng)液中，其zui大細胞密度不能超過5×105~106/ml。一般使用含有高糖的Dmem培養(yǎng)液，并補加有pH的穩(wěn)定劑HEPES。

2）免疫小鼠和脾細胞的制備
免疫：取6~8周齡Balb/C雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強免疫一次，3~5天后用于融合。
脾細胞制備：
1．引頸處死小鼠，用酒精消毒表體。
2．無菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次。
3．把脾臟置于已消毒的90~100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中。
4．在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，令細胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3 ml無血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細胞，再制成細胞懸液亦可。
5．把細胞懸液注入50ml離心管中，加10~20ml培養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5分鐘。
6．離心（800~1000轉(zhuǎn)/分）計數(shù)，備用。

3）飼細胞的制備：常用小鼠胸腺細胞或小鼠的腹腔細胞
小鼠腹腔細胞制備方法：
1．引頸處死小鼠，用酒精消毒表體。
2．切開腹部皮膚剝向兩側(cè)，暴露出腹壁。
3．用無菌7號針頭注射器，吸取3ml無血清培養(yǎng)液。
4．用小鑷夾起腹壁，注入3ml無血清培養(yǎng)液，用手反復(fù)輕輕揉腹壁，再反復(fù)抽吸3~5次。
5．收集末次吸得的細胞，注入50ml的離心管中，再加20ml無血清培養(yǎng)液，用吸管漂洗一次。
6．離心，去上清，用含血清培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度為2×105/ml，接種入培養(yǎng)板中，24孔板每孔加0.1ml。
4）細胞融合
HAT培養(yǎng)基的制備

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