實驗原理

所謂大腸菌群，是指在37℃培養24h 內能發酵乳糖產酸、產氣的兼性厭氧的革藍氏陰性無芽孢桿菌的總稱。主要由腸桿菌科中四個屬內的細菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。

水的大腸菌群數是指100 mL水檢樣內含有的大腸菌群實際數值，以大腸菌群zui近似數(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽孢桿菌等多種細菌。這些細菌都可以隨人畜排泄物進入水源，由于大腸菌群在腸道內數量多，所以，水源中大腸菌群的數量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標。目前，上已*大腸菌群是糞便污染的指標。因而對飲用水必須進行大腸菌群的檢查。

水中大腸菌群的檢測方法，常用多管發酵法和濾膜法。多管發酵法可適用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要的時間較長。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用于雜質較多、易于堵塞濾孔的水樣。

材料與器皿

(—)培養基

1、普通乳糖蛋白胨培養液

蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化鈉 5g，1.6%溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸餾水 1000mL，pH 7.2~7.4。

將蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調節pH為7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管10mL，115℃滅菌20min。

2、三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液

按上述普通乳糖蛋白胨培養液濃縮三倍配制，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管5mL。

1、 品紅亞硫酸鈉培養基(供平板分離用)

蛋白胨 10g， 乳糖 10g，K2HPO4 3.5g，瓊脂 15～20g，蒸餾水1000mL，無水亞硫酸鈉 5g，5%的堿性品紅乙醇溶液 20mL，pH 7.2~7.4。

4、伊紅美藍培養基(EMB培養基)(供發酵法平板分離用，3和4可任選一種)

蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，2%伊紅(曙紅)水溶液 20mL，5%美藍()水溶液13mL，pH 7.2~7.4。

(二)滅菌移液管、滅菌稀釋水、試管、杜漢氏小管、革蘭氏染色液、滅菌培養皿。

實驗過程

(一)水樣的采集

供細菌學檢驗的水樣，必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證再運送、貯存過程中不受污染。水樣從采集到檢驗不應超過4h ，在0～4℃下保存不應超過24h ，如不能在4h 內分析，應在檢驗報告上注明保存時間和條件。

1、自來水取樣：應在水打開放水5min ，再用無菌容器接取水樣，待分析。如水樣內含有余氯，則采樣瓶滅菌后按每500mL水樣加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。

2、江、河、湖、池自然水體取樣：可用采樣器，采樣瓶應先滅菌。采樣后，瓶內應留有空隙。如果與其他化驗項目聯合取樣，細菌學分析水樣應采在其他樣品之前。

(二)初發酵試驗

1、水樣稀釋：制備水樣10-1、10-2的稀釋液，方法為用無菌移液管吸取水樣10mL放于盛有90mL無菌水和若干玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩使混合均勻，并使其中的細菌盡量呈單個存在，即為10-1稀釋液;再從10-1制備10-2稀釋液。以此類推，稀釋到所需倍數。

2、接種和培養：以無菌操作于5支三倍濃縮培養基(接種前一定應先檢查杜漢氏小管內有無氣泡)中各加入水樣10mL，5支普通培養基試管中加入水樣1mL，5支普通培養基試管中加入10-1稀釋液1mL， 小心混勻放入37℃培養箱中培養24h 。此即5管法。

3、結果觀察：37℃中培養24h后取出觀察，觀察有無氣體(杜漢氏小管內有無氣體)和酸產生(培養基有無變色)。在48h之間，培養管內倒置的杜漢氏小管內有任何量的氣體積累，或培養基顏色從紫色變為黃色，便可初步斷定為陽性反應。

若實驗所測定的15支管中均為陽性反應，說明濃水樣污染嚴重，可將樣品進一步稀釋后，再按上述方法接種、培養和觀察。

(三)平板培養試驗

將初發酵實驗中產酸產氣的后只產酸或只產氣的試管中的培養物用接種環取少許，劃線接種在品紅亞硫酸鈉培養基或伊紅美藍培養基平板上，為了確保獲得分離的單菌落，須注意以下事項：

(1)劃線間距至少相隔0.5厘米;

(2)接種釘要稍彎;

(3)先對試管輕擊并使之傾斜，以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣;

(4)劃線時要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培養基平面.以免刮傷或戳破培養基。劃線后培養皿倒置，于37℃培養18～24h。

24h后，觀察在平板上出現的單個菌落，其核心有深綠色金屬光澤者為較典型的大腸菌群菌落。盡可能挑取典型的或接近典型的大腸菌群菌落，在營養瓊脂斜面上劃線，置37℃培養24h。挑取斜面培養物制成涂片，進行革蘭氏染色，凡屬革蘭氏陰性桿菌，即確認了大腸菌群細菌的存在.

(四)復發酵驗證實驗

經上述經染色為革蘭氏陰性的典型菌落，用接種環刮取部分接種于盛有乳糖培養基的試管中，在37℃培養24h，陽性反應者即確認為大腸菌群細菌。

結果計算

在初發酵試驗中，可能有極少數能發酵乳糖產氣的非大腸菌群細菌混在陽性可疑反應管中，通過對初發酵中的陽性可疑管進行平板和復發酵試驗，并進行革蘭氏染色和細菌形態的觀察，可將那些少量的非大腸菌群細菌(“假陽性管”)刪除去，故在記錄時只能把三步試驗都呈陽性的試管計入陽性反應管。

如果初發酵接種水樣量為10mL、1mL、0.1mL，可直接查表求出原水樣100mL中大腸菌群指數(MPN)。如果接種水樣量低于上述水樣量，則經下面的換算式計算。

目前我國系以1L水樣中的菌數為報告值，即為MPN×10。

水樣的總大腸菌群檢索表