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一 實驗目的
1.掌握質粒提取的原理及方法。
2.掌握瓊脂糖凝膠電泳的方法。
二 實驗原理
根據共價閉合環狀的質粒dna與線性染色體DNA片段之間在拓撲學上的差異發展起來的。在pH12-12.5時，線性DNA會*變性，而共價閉合環狀的DNA只是氫鍵斷裂，酸中和后，共價閉合環狀的DNA迅速準確地復性，而線性DNA聚合成網狀結構，與變性的蛋白和RNA一道離心沉淀，上清液中的質粒DNA用乙醇沉淀出來。
三 實驗步驟
已有許多方法用于從細菌中提純質粒DNA，這些方法都含有以下3個步驟：
1)細菌培養物的生長。
2)細菌的收獲和裂解。
3)質粒DNA的純化。
質粒DNA的小量制備可采用下述的堿裂解法或煮沸法。
1．堿裂解法：
（1）在5m1含相應抗生素的lb培養基中接種一單菌落，于37℃劇烈振蕩培養過夜。
（2）將1.5m1培養物倒入Eppendorf管中，用微量離心機于4℃以12000rpm離心30秒。
（3）吸去培養液，使細菌沉淀盡可能干燥。
（4）將細菌沉淀重懸于100μl用冰預冷的溶液I中，劇烈振蕩。
須使細菌沉淀在溶液Ⅰ中*分散，將兩個微量離心管的管底部互相接觸，按圖1所示方法同時進行振蕩，可使沉淀迅速分散。
質粒DNA的提取與純化
溶液Ⅰ
50mmol／L 葡萄糖
25mmol／L Tris·CI(pH 8．0)
10mmol／L EDTA(pH 8．0)。
在101bf／in2(6．895×104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。
（5）加200μl新配制的溶液Ⅱ．蓋緊管口，快速顛 倒離心管，以混合內容物。將離心管放置于冰上。
（6）加150μl用冰預冷的溶液Ⅲ。蓋緊管口，溫和地振蕩10秒鐘使溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3—5分鐘。
（7）4℃ 12000rpm離心10分鐘，將上清轉移到另一離心管中。
（8）加等體積氯仿，振蕩混勻， 4℃12000rpm離心10分種，將上清轉移到另一離心管中。
（9）用2倍體積的無水乙醇沉淀雙鏈DNA。溫和振蕩混勻，于-18℃放置20分鐘。
（10）用微量離心機于4℃以12000rpm離心10分鐘。
（11）棄上清，加入70%冷乙醇洗沉淀1-2次
（12） 真空干燥DNA沉淀后，將其溶于TE溶液中。
溶液Ⅱ（現用現配）
0.2mol／L NaOH
1％ SDS 溶液Ⅲ
5mol／L乙酸鉀 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
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