1.凝膠的選擇
根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號(hào)的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G25或G50，G250多用于分離蛋白質(zhì)單體，G200多用于分離蛋白質(zhì)凝膠聚合體等。
2.凝膠的預(yù)處理
稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同型號(hào)的凝膠而定。
凝膠量與型號(hào)和層析柱大小與規(guī)格及凝膠用量
| 層析柱規(guī)格 & @- q1 P( c' }* d | 凝膠的規(guī)格和用量（ g ） |
| 直徑（ cm） | 高（ cm） | 容量（ ml ） & L) Q+ ^/ `" i | G25 1 g. l% A5 @& s4 m" _0 ^* C | G50 , k3 L) X! ?% Y- _. ?* A; f | G100 0 K" k" G" q. ?: W+ ~ n | G200 |
| 0.9 | 15 ; N7 d) E3 u$ |8 t, d6 b$ R( x7 H8 { | 9.5 | 2.5 | 1 | 0.6 ( c, i" m, x; i2 p$ I# C3 B | 0.3 |
| 0.9 | 30 / p5 J5 L+ x, [& r+ A! R" T | 19 " M! z+ a* E' R0 Q6 b5 j | 5 $ | 2 | 1.2 | 0.6 ' |
| 0.9 | 60 2 e$ x7 x+ H: s, { | 38 . U: R7 D- Q8 _ | 10 | 4 $ V/ ?- `1 G" |( F, | | 2.5 | 1.2 |
| 1.6 $ \6 T# E! b5 r. J6 ^9 y" n | 20 | 40 | 10 . Y8 s- V7 V) N/ d | 4 7 @) o3 u$ u" g$ y | 2.5 + v, _1 z( R# {, V& Y) Y, N# j7 ~ | 1.2 |
| 1.6 | 40 2 v2 G' J+ w$ {- O | 80 | 20 | 8 9 X. k" q' }, L4 e; ?* n0 { | 5.0 ( O# B$ D/ }2 F6 \) U! @ | 2.4 7 Q! `# r/ Q) _7 H# \ |
| 1.6 | 70 |
| 35 | 14 | 9.0 . m# H$ W4 D0 i7 | | 4.4 |
| 1.6 | 100 | 200 2 H. |- [% W5 S9 `& ] | 50 | 20 | 12.5 | 6 ( O3 w. n+ J; y |
| 2.6 : T- v; ^) }- f& x | 40 2 Y# P! C2 u0 T. b2 ]4 V | 210 | 50 | 20 1 X7 P" u7 K) Q4 y( R5 c7 ~ | 12 - ]% Q4 J2 {4 o) ?, C, r$ @ | 7 1 ~7 y$ p( T; r. ]: C |
| 2.6 | 70 % c6 E: |$ H2 ~ ^7 M. f | 370 $ s4 u s. f% b1 {0 z8 x | 90 y9 f2 k% j& e5 u | 35 | 20 | 12 8 Y. I: U& Y! _+ m( a7 C+ W |
| 2.6 | 100 9 a1 X/ v7 o! ]$ j9 Z: l | 530 $ Q c8 y1 o' W& g9 Y( s | 130 k8 i1 ]5 F: t0 g0 t) A | 50 ! D$ q$ f" Q# T: x | 30 1 D/ {; c7 k8 ?/ }# ^ | 17 . l! O6 G0 f, f# U8 k7 ` |
| 2.6 $ ]7 o8 l' f- j; ^! W4 r4 z | | 60 1 G6 y* w4 H) x n | 1000 | 250 6 I, V$ G3 m1 |6 |' ] | 110 1 l0 y& \# `; @2 X | 70 ) r2 W; A2 o3 W! [( ]* D: y J) o; [ | 35 |
為使粒子均勻一致需進(jìn)行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉淀的粒子，如此反復(fù)數(shù)次即可。
3.裝柱
層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時(shí)，柱床體積應(yīng)為樣品體積的25～100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長(zhǎng)一些，分離效果好，但柱太長(zhǎng)，則延長(zhǎng)分離時(shí)間，樣品也稀釋過度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)。內(nèi)徑過細(xì)，會(huì)發(fā)生“器壁效應(yīng)"，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對(duì)于除鹽來說應(yīng)為1:5～1:25；對(duì)于純化蛋白質(zhì)來說應(yīng)為1:20～1:100。
4.加樣與洗脫
樣品體積不宜過多，為床體積的1%～5%，zui多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。
洗脫液應(yīng)與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會(huì)發(fā)生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強(qiáng)度和pH值。分離血清蛋白常用0.02～0.1Mol/LpH6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/LNaCl）和0.1Mol/LpH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液（0.14Mol/LNaCl）。
5.洗脫液收集
利用自動(dòng)分步收集器收集，并以20%磺基水楊酸測(cè)試，當(dāng)?shù)鞍滓合聛頃r(shí)，開始分管收集，至無蛋白液為止。
6.凝膠柱的重復(fù)使用與保存
當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可加入新的樣品，繼續(xù)使用。保存方法有三種：
（1）在液相中保存zui方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑（如0.002%洗必泰）或高壓滅菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
（2）用完后，以水沖洗，然后用60%~70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態(tài)下保存。
（3）不用者，以干燥狀態(tài)保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，zui后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于60℃~80℃干燥后保存。加乙醇時(shí)，切忌一上來就用濃乙醇處理，以防結(jié)塊。
