所謂亞克隆就是對已經獲得的目的dna片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。
亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。 
一、試劑準備
1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細菌培養用）10g，酵母提取物（細菌培養用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，*溶解，分裝小瓶，15lbf/in2高壓滅菌20min。
2．1.5%瓊脂LB固體培養基: 稱取1.5g瓊脂粉放入300ml錐形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高壓滅菌20min，稍冷卻，制備平皿。
3．IPTG、X-Gal
4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高壓滅菌20min，0℃冰浴備用。
5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高壓滅菌20min，0℃冰浴備用。
6．限制性核酸內切酶、T4 dna連接酶。
二、目的DNA片段和載體的制備
選擇適宜的限制性核酸內切酶，消化已知目的DNA和載體，獲得線性DNA，用于重組。根據目的DNA和載體的具體情況，選擇一種或者兩種適當的限制酶切割，分別產生對稱性粘性末端（用一種限制性內切酶進行消化而產生帶有互補突出端）、不對稱粘性末端（用兩種不同的限制性內切酶進行消化而產生帶有非互補突出端）、平端。在亞克隆時，不對稱相容末端連接，次選對稱性粘性相容性末端連接，由于平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時目的片段的末端與載體不匹配 ，一般先將不匹配末端補平，然后再以平末端連接。（實驗操作同前述） 
三、利用T4 DNA連接酶進行目的DNA片段和載體的體外連接
（一）連接要求和結果 
外源DNA片段末端性質 連接要求 連接結果 
不對稱粘性末端 兩種限制酶消化后，需純化載體以提高連接效率 載體與外源DNA連接處的限制酶切位點常可保留；非重組克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中。 
對稱性粘性末端 線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理 載體與外源DNA連接處的限制酶切位點常可保留；重組質粒會帶有外源DNA的串聯拷貝；外源DNA會以兩個方向插入到載體中。 
平端 要求高濃度的DNA和連接酶 載體與外源DNA連接處的限制酶切位點消失；重組質粒會帶有外源DNA的串聯拷貝；非重組克隆的背景較高 。 
帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線性質粒載體中,但是在連接反應時,外源DNA和質粒都可能發生環化,也有可能形成串聯寡聚物。因此，必須仔細調整連接反應中兩個DNA 的濃度，以便使“正確"連接產物的數量達到*水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團以抑制載體DNA的自身環化。利用T4 DNA連接酶進行目的DNA片段和載體的體外連接反應，也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸（未脫磷），可形成4個新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，此時產生的重組DNA帶有兩個單鏈缺口，在導入感受態細胞后可被修復。
（二）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案
1．連接反應一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。
2．10μl體積反應體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數為1∶1-1∶5），補足ddH2O 至8μl。
3．輕輕混勻，稍加離心，56℃水浴5min后，迅速轉入冰浴。