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實驗目的
1. 學會DNA限制性內切酶酶切技術。
2. 瓊脂糖凝膠電泳法觀察酶切DNA的結果。
實驗原理
質粒pUC118上有限制性內切酶BamHI的識別序列G↓GATCC，用BamHI酶切后形成線性質粒dna。瓊脂糖凝膠電泳可以按酶切產物分子量的大小分離DNA片段，小片段比大片段遷移快，凝膠上遷移的距離與分子量的對數成反比。要準確地確定DNA片段的大小，必須用分子量標準物同時進行電泳對照。常用的分子量標準是lDNA/EcoRI、lDNA/HindIII、lDNA/EcoRI+HindIII的酶切片段
DNA的限制性內切酶酶切
DNA的限制性內切酶酶切
實驗材料和試劑
（一）實驗材料
實驗二提取的質粒pUC118???
（二）試劑
1．限制性內切酶BamHI
2．l DNA/HindIII分子量標準
3．雙蒸餾無菌水
4．溴酚藍指示劑點樣緩沖液
5．1mg/ml溴化乙錠溶液
6．電泳緩沖液（TAE）
7．0.7% 瓊脂糖凝膠（用TAE電泳緩沖液配制）
（三）器材
1.5ml Eppendorf管 200ml吸頭
（四）儀器
微量移液器 離心機
恒溫水浴鍋 電泳儀
水平電泳槽 透射紫外觀察儀
實驗步驟
1. 取一個滅菌的Eppendorf管，依次加入下列試劑：
雙蒸餾無菌水 12ml
10×BamHI緩沖液 2ml
質粒pUC118 5ml
BamHI 1ml
總體積 20ml
2. 用手指輕彈管壁，使各種試劑混勻，快速離心，以集中溶液。
3. 置37℃水浴60～120 分鐘。
4. 加入5ml溴酚藍指示劑點樣緩沖液，按實驗三方法電泳，觀察酶切反應結果，鑒定酶切效果。
【提示】
實驗操作中注意的問題
1. 酶切反應用的Eppendorf管和吸頭，都要用新的，用雙蒸餾水洗凈，滅菌。使用前打開包裝，用鑷子夾取，不要直接用手去拿，以防手上的雜酶污染。
2．DNA樣品和限制性內切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性及全部放入反應體系中。
3．要注意酶切加樣的次序，一般次序為雙蒸餾無菌水、緩沖液、DNA各項試劑，zui后才加酶。
4．取酶時，吸頭要從酶液的表面吸取，以防止吸頭沾上過多的酶液。待用的酶要放在冰浴內，用后蓋緊蓋子，立即放回-20℃冰箱中，防止酶失活。
5．當樣品在37℃保溫時，要將Eppendorf管的蓋子蓋緊，防止因蓋子未蓋嚴密使水進入管內，造成實驗失敗。
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