實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>學(xué)習(xí)從兔肝中提取RNA的方法。
通過(guò)地衣酚顯色法測(cè)定RNA的含量。
實(shí)驗(yàn)原理：
細(xì)胞內(nèi)大部份RNA均與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分離制備RNA時(shí)，首先遇到的是必須使RNA與蛋白解離，并除去蛋白質(zhì)。由于RNA的種類來(lái)源和存在形式不同，所用的制備方法各異，一般常用的方法有，鹽酸胍法，去污劑法和法。其中，以法使用較為廣泛。產(chǎn)品純度高，適合小規(guī)模生產(chǎn)。
動(dòng)物組織中以肝臟器官RNA含量較為豐富。經(jīng)組織勻漿用處理并離心后RNA溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中，向水層中加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法能較好的除去DNA和蛋白質(zhì)。上述方法提取的的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA；其工藝簡(jiǎn)單，所提取的核酸均為變性RNA，只能用作制備核苷酸原料。本實(shí)驗(yàn)就是將兔肝組織，在酚與十二烷基硫酸鈉的存在下，RNA與蛋白質(zhì)分離使蛋白質(zhì)變性凝固。RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA從水相中沉淀，達(dá)到分離。
RNA含量的測(cè)定，除了可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法測(cè)定，其反應(yīng)原理是當(dāng)RNA與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，后者與3， 5-二羥甲苯（地衣酚orcinol)反應(yīng)，在Fe3+或Cu２+催化下，生成鮮綠色的復(fù)合物．反應(yīng)產(chǎn)物在670nm處有zui大吸收。RNA在20－250微克范圍內(nèi)，光吸收與RNA濃度 成正比。地衣酚反應(yīng)特異性較差，凡是戊糖均有此反應(yīng)。DNA和其他雜質(zhì)也能給出類似的顏色。
實(shí)驗(yàn)試劑
0.05mol/L醋酸緩沖液（PH5.0）
0.05mol/L醋酸鈉35毫升， 0.2mol/L醋酸15毫升，加蒸餾水至1000毫升，混合后測(cè)PH5.0
25%SDS:稱取SDS25克，溶于50％乙醇中至100毫升，室溫存放。
80％酚：取80份，加蒸餾水20份，混勻后裝棕色瓶中。
2mol/L醋酸鈉：取無(wú)水醋酸鈉16。4克，用蒸餾水溶解后配成100毫升
95％乙醇
操作步驟
RNA提取：將新鮮兔肝浸入預(yù)冷0度0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(PH5.0)中,除去肝臟處的結(jié)締組織,除去血凝,用濾紙吸干,稱取0.9克.
取0.9克肝臟,加入 0.05mol/L醋酸緩沖液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入勻漿管中,勻漿后再加入等體積80%酚,再勻漿一次.
移入三角瓶中,置65度水浴中繼續(xù)振搖5-8分,取出流水冷卻.
離心,3000轉(zhuǎn)/分,10-15分,上層為稍混濁,含有RNA的水相,中層為變性蛋白,下層為酚液,管底殘?jiān)?含有RNA.吸出上層水溶液要RNA的收獲量,可向中下層液中再加1/2體積的醋酸緩沖液,同樣在65度水浴中振搖提取一次,離心后所收得的上層水液,可與上述水液合并,本次實(shí)驗(yàn)只提取一次.
用量筒測(cè)水液的量,加入1/10體積的2mol/L醋酸鈉混勻.再加入2.5倍體積預(yù)冷的95%乙醇混勻,冷卻放置絮狀沉淀充分形成.
離心3000轉(zhuǎn)/分,10分鐘,傾出上清(不要廢棄,可倒入收集瓶,作蒸餾回收乙醇用.
沉淀用蒸餾水4毫升溶解,慢慢向沉淀中加入蒸餾水,不斷攪拌,至沉淀*溶解即可,待作含量測(cè)定.
提取過(guò)程
RNA含量測(cè)定
標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:取試管12只,按下表編號(hào)加入試劑,加畢,搖勻,沸水浴中加熱25分鐘,取出后冷水冷卻,測(cè)定各管0D670為縱坐標(biāo),RNA濃度為橫坐標(biāo)作圖
測(cè)定過(guò)程
管號(hào)/試劑ml
0
1
2
3
4
5
6
7
RNA標(biāo)準(zhǔn)液
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸餾水
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
地衣酚試劑
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
取兩支試管各加入0.2ml待測(cè)液，再加1.8ml水和2.0ml地衣酚試劑，加畢，搖勻，沸水加熱25分鐘，取出后冷水冷卻，測(cè)定各管OD680為縱坐標(biāo)，RNA濃度為橫坐標(biāo)作圖并計(jì)算提出的RNA 的量。并計(jì)算出RNA的收率.
