質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌的方法

時間：2016-7-18閱讀：966

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)外源DNA導(dǎo)入原核生物細(xì)胞的方法

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

熱激處理將外源質(zhì)粒dna導(dǎo)入原核細(xì)胞。

三、實(shí)驗(yàn)原理

利用CaCl2處理感受態(tài)體細(xì)胞，然后通過熱休克處理，即置于42℃高溫?zé)峒?0秒，熱休克后，需要使受體細(xì)胞在不含有抗生素的培養(yǎng)液中生長至少半小時以上，使其表達(dá)足夠的蛋白，以便能在含有抗生素的平板上生長菌落。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌的方法
1、制備含有Amp抗生素的LB平板。

2、取一個1.5ml離心管，加入100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液，置冰上：加入20ul質(zhì)粒T+G(提取的質(zhì)粒DNA稀釋500X)，用移液器輕柔混勻。冰上靜置20min。

3、 42℃水浴中熱激90秒，然后迅速置冰上3~5min。整個過程不要振蕩菌液。

4、加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)(180rpm)1小時，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因。

5、取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固體培養(yǎng)基上，涂布均勻。

6、待菌液被培養(yǎng)基吸收后，37℃倒置培養(yǎng)12~16小時，菌落生長良好而又未互相重疊時，取出。

7、計算轉(zhuǎn)化率

8、統(tǒng)計每一個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。

9、轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：

10、轉(zhuǎn)化子總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積;

11、轉(zhuǎn)化頻率(轉(zhuǎn)化子數(shù)/μg質(zhì)粒DNA)=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/質(zhì)粒DNA加入量(μg)

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