內參即是內部參照,它們在各組織和細胞中的表達相對恒定,在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。其作用是校正上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差,保證實驗結果的準確性。借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差,這樣半定量的結果才更為可信。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下不會發生表達改變的基因作內參。
在進行基因研究的過程中,實時反轉錄 PCR也和傳統的mRNA定量方法如 Northern b lot技術等一樣, 要求使用參照基因以校正轉錄效率和 cDNA用量, 彌補制備過程中樣本純度和濃度的差別, 使不同樣本之間目的基因的比較成為可能,以期獲得真實可靠的結果。大多數分析方法中這些差別可通過與內參照比較處理消除。zui普通的內參照是內源性參照基因,也叫管家基因。
管家基因:又稱持家基因(house-keeping genes)生物體各類細胞中都表達,其產物是對維持細胞基本生命活動所必需的蛋白質編碼的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。是 為維持細胞基本生命活動所需而時刻都在表達的基因。
管家基因表達水平受環境因素影響較小,而是在個體各個生長階段的大多數、或幾乎全部組織中持續表達,或變化很小。它的表達只受啟動序列或啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響,而不受其他機制調節。 管家基因高度保守并且在大多數情況下持續表達,因此管家基因常被用于分子技術--多位點基因分析。
內參基因通常是各種看家基因,在細胞內組成穩定性表達,有助于保持細胞的功能。理想的內參基因應該滿足以下條件:1, 不存在假基因(Pseudogene),以避免基因 DNA的擴增; 2,高度或中度表達,排除低表達; 3,穩定表達于不同類型的細胞和組織(如正常細胞和癌細胞),而且其表達量是近似的,無顯著性差別; 4,表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關;5, 其穩定的表達水平與目標基因相似;6, 不受任何內源性或外源性因素的影響,如不受任何實驗處理措施的影響.
近年來的研究發現:這些常用內參基因均存在缺陷,在不同類型的細胞和組織 細胞增殖和器官發育的不同階段 體外培養 各種實驗條件等情況下它們的表達量通常變異較大。正確的選擇內參基因, 很大程度上依賴所研究的細胞或組織, 不同的試驗需要尋找適合各自試驗體系的特異性穩定表達的內參基因。然而,合適內參基因的選擇,需要在各種類型的細胞或組織和各種試驗條件下進行比較選擇。理想的內參基因應在各種試驗條件下,各種類型的組織和細胞中均恒定表達,而且其表達量是近似的,無顯著性差別。另外要求不存在假基因以避免基因組的擴增。