DNA螢光染色法
· 原理︰利用螢光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測支原體污染。此染劑會結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區(qū)域，因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%），所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點(diǎn)，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。
· 測試步驟用間接步驟，將待測細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞培養(yǎng)液接種于指示細(xì)胞培養(yǎng)液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培養(yǎng)指示細(xì)胞再作螢光染色。正負(fù)反應(yīng)對照組亦可以接種于indicator cell內(nèi)作為對照。
· 待測細(xì)胞亦可作直接測試，但需為吸附型細(xì)胞，培養(yǎng)后直接作螢光染色。有些細(xì)胞易有螢光背景，而干擾結(jié)果判讀，則建議使用接種于指示細(xì)胞之步驟。
· 特點(diǎn)︰簡單、經(jīng)濟(jì)與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟。可以偵測不易培養(yǎng)之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養(yǎng)法快，約一星期即可知道結(jié)果。
· 缺點(diǎn)：有時(shí)仍會有螢光背景，影響判讀。
材料︰
· Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內(nèi)放置無菌22x22mm蓋玻片﹙浸于酒精內(nèi)，使用前過火滅菌﹚，一般吸附型細(xì)胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片，細(xì)胞面朝下放在玻片上觀察。
· Indicator Cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，細(xì)胞須先測試無污染。αMEM with 10%FBS ( medium for Vero cell)
配制試劑:
· 無菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。
· Hoechst 33258 stock solution（100X）︰稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至*溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20℃。
· Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4℃。
· mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH調(diào)整pH至5.5（pH很重要），貯存于4℃。
· 固定溶液（fixative）︰冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例混合，使用前才配制。
步驟：
· 培養(yǎng)Vero細(xì)胞： Vero細(xì)胞可作培養(yǎng)或制作多個(gè)冷凍保存管，測試前解凍培養(yǎng)。測試前一周培養(yǎng)Vero細(xì)胞。
· 在接種測試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液，以1~2x10^4 cells／ml培養(yǎng)于chamber slide中，每個(gè)well加入1ml細(xì)胞懸浮液，于37℃, 5％CO2培養(yǎng)。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品。
· 接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養(yǎng)基，1ml待測細(xì)胞培養(yǎng)液（可將細(xì)胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷凍管之細(xì)胞懸浮液。
· 將測試樣品加入chamber slide內(nèi)，培養(yǎng)5天后，進(jìn)行Hoechst 33258的螢光染色觀察。
· 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細(xì)胞作為正反應(yīng)對照組﹙或是已感染支原體之細(xì)胞培養(yǎng)液或冷凍細(xì)胞液﹚，負(fù)反應(yīng)對照組為Vero cell之新鮮培養(yǎng)基( αMEM +10%FBS)。
DNA螢光染色檢測︰
· 取出培養(yǎng)5日之Vero細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液。于每個(gè)well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液。重復(fù)上述之步驟，風(fēng)干10分鐘。
· 于每個(gè)well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30 min。
· 吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗滌3次，風(fēng)干后加入1滴的mounting solution，并以蓋玻片覆蓋之。
· 以100x-400x螢光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后，以UV激發(fā)光束(330～380 nm)之濾光鏡，觀察細(xì)胞核外是否有藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)之螢光物產(chǎn)生。
結(jié)果判讀︰
若有支原體污染，在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)。其形狀一致，與細(xì)胞殘片染成之不規(guī)則點(diǎn)狀物不同。其螢光可維持?jǐn)?shù)星期。
圖例 (A)為negative result : 螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核，測試樣品沒有支原體的污染。(為positive result : 在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn)，表示測試樣品有支原體的污染。
(A)Negative result
螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核，測試樣品沒有支原體的污染。
細(xì)胞支原體污染的熒光檢測方法
