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凝膠遷移實驗系列二-實驗操作方法
點擊次數：248 發布時間：2012-10-16
凝膠遷移實驗系列二-實驗操作方法
1.探針的標記：
（1） 如下設置探針標記的反應體系：
待標記探針 （1.75pmol/微升） 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升
T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升） 1微升
總體積 10微升
按照上述反應體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。
（2） 使用水浴或PCR儀，37℃反應10分鐘。
（3） 加入1微升探針標記終止液，混勻，終止探針標記反應。
（4） 再加入89微升TE,混勻。此時可以取少量探針用于檢測標記的效率。通常標記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標 記到了探針上。為實驗簡便起見，通常不必測定探針的標記效率。
（5） 標記好的探針立即使用，zui長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20℃。
2.探針的純化：
通常為實驗簡便起見，可以不必純化標記好的探針。在有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：
（1） 對于100微升標記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。
（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時，或在-20℃沉淀過夜。
（3） 在4℃，12000g-16000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。
（4） 在4℃，12000g-16000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。
（5） 加入100微升TE，*溶解沉淀。標記好的探針立即使用，zui長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存于-20℃。