利用合成的*抗原(BSA-ENR)免疫小鼠,通過細胞融合技術和間接競爭ELISA篩選出了能分泌*單克隆抗體的雜交瘤細胞株,以此為基礎研制*殘留檢測的競爭ELISA試劑盒(competitive ELISA ENR-Kit),并測定其性能。結果表明:篩選出的2株雜交瘤細胞,單抗亞類均為IgG1型,其中4G1-B3株的ENR mAb間接ELISA效價為1:1.024×106,親和常數(shù)(Ka)為9×1010L/mol;競爭ELISA試劑盒的線性檢測范圍為0.05~101.6μg/L、靈敏度0.05μg/L、半數(shù)抑制濃度(IC50)1.1μg/L,與其他化合物的交叉反應率(CR%)均小于0.01%,雞肉樣、雞肝樣、魚肉樣和牛奶樣的平均添加回收率分別為81.5%8、7.6%、84.3%和95%,不同基質(zhì)添加*標準品做競爭ELISA對ENR-Kit檢測結果影響小,試劑盒保存期6個月以上。結果說明該競爭ELISA試劑盒具有快速、敏感、特異、簡便等特點,適用于ENR殘留的快速檢測。

ELISA測定親和常數(shù),其中4G1-B3株的親和常數(shù)為9×1010L/mol,4G1-G1株的親和常數(shù)為4·5×1010L/mol,結果見圖1,依據(jù)抗體親和力理論[13,14],親和力較好。Ig亞類鑒定為IgG1亞型。選擇親和常數(shù)zui大的4G1-B3株制備的腹水研制競爭ELISA試劑盒。圖1　*單抗的親和常數(shù)測定曲線Fig.1　Association constant (Ka) curve of ENR mAb2·2　競爭試劑盒的性能參數(shù)2·2·1　ENR mAb與HRP-ENR工作濃度　方陣滴定結果顯示,ENR mAb的*工作濃度為1∶128000;HRP-ENR的*工作濃度為1∶1000。2·2·2　靈敏度和標準曲線　ENR mAb對ENR的抑制曲線如圖2所示,回歸方程Y=-0·2538X+0·5095,相關系數(shù)R2=0·9913。競爭ELISA檢測20個空白標準品,所得平均值為1·02

ENR的*工作濃度為1∶1000。2·2·2　靈敏度和標準曲線　ENR mAb對ENR的抑制曲線如圖2所示,回歸方程Y=-0·2538X+0·5095,相關系數(shù)R2=0·9913。競爭ELISA檢測20個空白標準品,所得平均值為1·02,標準差為0·085;LOD為(B0-2s)/B0的值所對應的標準曲線的*濃度,代入曲線回歸方程計算出LOD=0·05μg/L,即ENR-Kit的靈敏度為0·05μg/L。ENR-Kit的線性檢測范圍為0·05~101·6μg/L。根據(jù)回歸方程計算出ENR mAb對ENR的半數(shù)抑制濃度IC50為1·1μg/L。圖2　ENR-4G1-B3單抗對ENR的抑制曲線Fig.2　Inhibitory curve of 4G1-B3 mAb2·2·3　特異性　由表1可知,*與其他沙星類化合物以及其他常用抗生素類化合物的交叉反應率均小于0·01%

90·5%~98·4%,平均95%,CV為4·6%~9·5%,平均6·8%。說明ENR-Kit具有較高的準確度。2·2·5　基質(zhì)效應性　如圖3所示5種基質(zhì)標準曲線的IC50分別是:PBS處理液為1·1μg/L、牛奶樣處理液為1·45μg/L、雞肝樣品處理液為2·0μg/L、雞肉樣處理液為2·61μg/L、魚肉樣處理液為2·94μg/L。結果說明,盡管不同生物基質(zhì)對標準品的吸光值有一定影響,但其IC50變化不大,對ENR-Kit的敏感性和檢測結果影響不大,可見上述樣品的處理方法是可行的。901　6期抗*單克隆抗體雜交瘤細胞株的篩選及競爭ELISA試劑盒的研制