液相色譜法分析人參皂苷
摘要：人參皂甙compound—K（C—K）在人參中的含量極低，但它是其他含量較高的人參皂甙Rbl和Rb2等在人體腸道內的主要降解產物和zui終吸收形式，具有很高的生物活性。參照藥典2010版采用501液相色譜儀來測定了人參總皂甙發酵液中c—K的含量。色譜條件為：VertexC18柱；乙腈-水（體積比為48：52）溶液為流動相，流速1.0mL/min；紫外檢測波長203 nm；柱溫35℃；外標法定量。結果表明：C—K的質量濃度為0.05～0.8g/L時，其峰面積與質量濃度具有良好的線性關系，相關系數為0.9998。方法的檢測限（S/N=3）為2.5mg/L，峰面積測定值的相對標準偏差（n=6）為2.2%。測定栽培人參總皂甙及三七莖葉總皂甙微生物發酵液中c—K 的平均加標回收率（ n=3）分別為98.6%和99.7%。該方法快速簡便，準確可靠，可用于c—K 的制備研究及藥物開發。
關鍵詞：液相色譜法；501液相色譜儀，人參皂甙compound—K；人參；三七
人參在我國和東亞的應用已有數千年，作為滋補強身的藥材也已聞名*。人參皂甙（ginsen—oside）被認為是人參各種藥理和生物活性的主要有效成分，屬于三萜皂甙，其中人參皂甙Rbl，Rb2。Rc，Re和Rgl等含量較高。人參皂甙compound-K（C-K）[20-O-D-glucopyranosyl-20-（S）-proto-panaxadio1]，其分子式為C16H64O8 ，在人參中的含量極低，但它是人參皂甙Rbl，Rb2和Rc在人體腸道內的主要降解產物和zui終吸收形式。近年來，體內體外試驗研究發現，許多生物學活性都是由該化合物引起的，如抑制腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移，抗過敏，抑制化學致癌劑誘導的染色體基因突變等 ，因此對它的研究越來越受到重視。目前，C—K主要是通過微生物發酵法和酶法獲得 。C—K含量測定方法學的研究對人參皂甙發酵液及其制品的質量控制、發酵工藝的優化以及C—K體內代謝吸收的研究均有十分重要的意義。采用液相色譜法（HPLC）測定人參皂甙含量，在國內外均有報道 ，而有關人參及其制品中C—K的含量測定則未見報道。本文采用反相液相色譜法（RP—HPLC）測定栽培人參總皂甙和三七莖葉總皂甙微生物發酵液中C—K的含量，方法具有簡便快速、結果準確等優點，且樣品經提取、濃縮、定容后不需要進一步純化。
l 實驗部分
1．1 儀器、試劑及樣品
501二元梯度泵；可變波長紫外檢測器和GLP色譜工作站；Acculab ALC一1 l0．4型分析天平（德國Sartorius公司）；RE一52A 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。甲醇、乙醇（分析純，上海化學試劑公司）；乙腈（HPLC純，DIKMA公司）；超純水（由德國Sartori—US公司Arium 631系列實驗室超純水器制備）。C-K標準品：本實驗室自制；栽培人參總皂甙：撫順鑫泰參茸保健品公司提供，總皂甙含量81．56％ （質量分數）；三七莖葉總皂甙：云南紅云生物技術公司提供，總皂甙含量80．52％ （質量分數）。
1．2 色譜條件
色譜柱：VertexC18 4.6×250mm,5um；流動相：乙腈-水（體積比為48：52）溶液，流速1.0mL／min；檢測波長：203nm；柱溫：35℃ ；進樣量：l0uL。
1．3 標準溶液的制備
精密稱取C-K標準品5.0mg，用甲醇溶解并定容至5mL，配制成1.0g／L的標準儲備溶液。從中準確吸取適量配成0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g／L的系列標準溶液。
1．4 樣液的制備
1．4．1 人參總皂甙樣液的制備
分別準確稱取30.0mg栽培人參總皂甙和三七莖葉總皂甙，各用甲醇配成10mL質量濃度為3g／L的溶液，經0.45m濾膜過濾后作為測定樣液。1.4.2人參總皂甙發酵液樣品溶液的制備取栽培人參總皂甙和三七莖葉總皂甙的發酵液各30mL（人參總皂甙質量濃度為5g／L），先用30mL乙醇浸提24h，再過濾除去菌體。濾液減壓蒸干后，用5mL甲醇溶解，將溶解液高速離心（12000r／min）lOmin。準確移取上清液1mL，用甲醇稀釋30倍，經0.45 izm 濾膜過濾后供試。
1．5 定量方法
采用外標法定量。以峰面積對質量濃度做工作曲線，再由試樣中組分的峰面積求出試樣中組分的實際濃度。
2 結果與討論
2．1 人參皂甙compound-K 的色譜行為本研究在乙腈一水流動相體系中進行，選擇乙腈與水的體積比分別為30：70，43：57，48：52，55：45，60：40，結果以乙腈與水的體積比為48：52的分離效果。在此條件下不僅C—K與其他皂甙類成分達到基線分離，而且峰形好，檢測靈敏度高。C—K標準品、發酵前后栽培人參總皂甙及三七莖葉總皂甙的色譜圖見圖1。
結語
本方法的建立為菌株改良、發酵與分離工藝優化，提高發酵轉化率和分離提取的收率提供了一個有效的分離分析手段，為實現人參皂甙compound．K生產工業化及開發抗腫瘤新藥奠定了基礎。
參考文獻：
人參皂苷、三七皂苷液相色譜法
[1] Akao T，Kida H，Kanaoka M ．Hattori M．Kobashi K JPharm Pharm acol，2011． 50：l l55
[2] Lee S J，Sung J H，Lee S J，Moon C K．Lee B H．CancerLetters，2011，l44（1）：39
關鍵詞：501液相色譜儀，人參皂苷，液相色譜法
