限制性內切酶識別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據識別位點兩邊的若干個堿基，這些堿基對內切酶穩定的結合到DNA雙鏈并發揮切割DNA作用是有很大影響的，被稱為保護堿基。

添加保護堿基的目的

    在分子克隆實驗中，有時我們會在待擴增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點，用于后續的酶切和連接反應。但實驗證明，大多數限制酶對裸露的酶切位點不能切斷。必須在酶切位點旁邊加上一個至幾個保護堿基，才能使所定的限制酶對其識別位點進行有效切斷。因此在設計PCR引物時，為保護5` 端外加的內切酶識別位點，人為地在酶切位點序列的5‘端外側添加額外的堿基序列，即保護堿基，用來提高酶切時的活性，使酶切*。

其次，在分子克隆實驗中選擇載體的酶切位點時，相臨的兩個酶切位點往往不能同時使用，因為一個位點切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點切割。

添加保護堿基的原則

    添加保護堿基，需要考慮兩個因素：一是堿基數目，一是堿基種類。

    添加保護堿基時，zui關心的應該是保護堿基的數目，而不是種類。什么樣的酶切位點，添加幾個保護堿基，是有數據可以參考的。

    一般情況下，普通的內切酶只加入兩個保護堿基，其內切反應就可以正常進行;而有一類，僅僅只加入兩個保護堿基，其內切反應就不能正常進行，這是因為內切酶不能正常結合DNA段上。如NdeI就屬這類，需要加入至少6個保護堿基，常用的HindIII也要三個。

   添加什么保護堿基，如果嚴格點，是根據兩條引物的Tm值和各引物的堿基分布及GC含量。如果某條引物Tm值偏小，GC%較低，添加時多加G或C，反之亦反。

    為了解不同內切酶對識別位點以外zui少保護堿基數目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進行實驗。實驗結果對于確定雙酶切順序將會有幫助（比如在多接頭上切割位點很接近時），或者當切割位點靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識別位點兩端至少加上6個保護堿基，以確保酶切反應的進行。

   當在引物5’端添加酶切位點時要考慮：

   1）該目的序列內部不得含有相同的酶切位點，這樣的錯誤會給將來的克隆造成麻煩。

   2）如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位點的外側再加上保護堿基，不同的酶對于保護堿基的要求是不同的。

   如果不設計保護堿基，則多半要用TA 克隆的方式連接到質粒上，這時要注意Taq 酶的選擇，若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。

    當計算引物Tm 值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。