細胞凍存和細胞復蘇的方法步驟

【資料簡介】

細胞株（系）的使用，為醫學研究和測試工作帶來了極大的方便。但細胞的傳代是有限制的，長期連續傳代的細胞，不僅消耗大量的人力和物力，而且細胞的生長與形態等會有一定退變或轉化，因而細胞失去原有的遺傳特性，有時還會由于細胞污染而造成傳代中斷，種子丟失。因此，在實際工作中常需凍存一定數量的細胞，以備替換使用。細胞冷凍與復蘇是細胞培養室的常規工作和通用技術。
細胞的凍存
一、概述
目前，細胞凍存zui常用的技術是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞內外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞脫水使局部電解質濃度增高，pH值改變，部分蛋白質由于上述原因而變性，引起細胞內部空間結構紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞內結構成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復合體也易破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞內容物丟失。如果細胞內冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核DNA空間構型發生不可逆的損傷，而致細胞死亡。因此，細胞冷凍技術的關鍵是盡可能地減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內的水分滲出細胞外，減少胞內形成冰結晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。
二、細胞凍存操作步驟：
（1）選擇處于對數生長期的細胞，在凍存前一天換液。將多個培養瓶中的細胞培養液去掉，用0.25% *消化。適時去掉*，加入少量新培養液。用吸管吸取培養液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心（1000r/min，10分鐘）。
（2）去上清液，加入含20%小牛血清的*培養基，于4℃預冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為3×106～1×107/mL之間。
（3）將上述細胞分裝于安瓿或冷凍塑料管中，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要*封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細胞種類及代次、凍存支數）。
（4）將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內；置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時，再移至冰箱冷凍室內3～4小時（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態部分存放2小時，zui后沉入液氮中。
細胞凍存在液氮中可以長期保存，但為妥善起見，凍存半年后，取出一只安瓿細胞復蘇培養，觀察生長情況，然后再繼續凍存。
三、常用冷凍設備和材料
常用的細胞冷凍貯存器為液氮貯存器，規格有35L3和50L3兩種。使用時要注意以下幾點：
（1）一般兩周需充液氮一次，至少一個月充氮一次。液氮溫度達-196℃，使用時注意勿讓液氮濺到皮膚上，以免引起凍傷。
（2）液氮容器為雙層結構，中間為真空層，瓶口有雙層焊接處，應防止焊接部裂開。
（3）在裝入液氮時，要注意緩慢小心，并用厚紙卷筒或特制漏斗作引導，使液氮直達瓶底，如有液氮灌注裝置則更好。若為初次使用，加液氮時更要緩慢，以免溫度驟降而使容器損壞。
細胞凍存時常備的材料有：0.25%*，含10%～20%的血清培養液，DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（121°C蒸氣高壓消毒），2mL安瓿（或細胞凍存管）、吸管、離心管、噴燈、紗布袋（或凍存管架）等。
細胞的復蘇
一、細胞復蘇的原則
在實際操作中，凍存細胞要進行復蘇，再培養傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內，再次形成胞內結晶損傷細胞。
二、細胞復蘇的主要操作步驟
（1）佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。
（2）迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內使其*融化，然后在無菌下取出細胞。
（3）在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養液后接種于培養瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養，次日更換一次培養液，繼續培養，觀察生長情況。若細胞密度較高，及時傳代。或無需離心直接將細胞加入瓶中，并加入培養基貼壁培養12～24小時后，充去上清，換入新鮮培養基繼續培養。
三、注意事項
在細胞復蘇操作時，應注意融化凍存細胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過zui易受損的溫度段（-5～0℃）。這樣復蘇的凍存細胞存活率高，生長及形態良好。然而，由于凍存的細胞還受其他因素的影響，有時也會有部分細胞死亡。此時，可將不貼壁、飄浮在培養液上（已死亡）的細胞輕輕倒掉，再補以適量的新培養液，也會獲得較為滿意的結果。