動物細胞培養與觀察

【資料簡介】

細胞培養是將器官、組織或細胞從生物機體中取出，模擬該器官、組織或細胞在機體內的生理條件，在體外進行培養，使其能夠繼續生存、生長和繁殖。一些研究結果表明，許多種類的動物或植物的細胞都能在人工培養條件下生存、生長和繁殖。
現代的動物細胞培養始于美國動物學R.G.Harrison。他于1906年在無菌條件下，以淋巴液做培養基，培養了蝌蚪的神經板，并觀察到神經細胞突起生長的過程。到了20世紀后半葉，隨著分子生物學和細胞生物學的崛起，為了在活細胞中研究生命現象，細胞培養方法得到了廣泛的發展和應用。
細胞培養的突出優點，一是便于研究各種物理、化學等外界因素對細胞生長、發育和分化等的影響。因為人工培養條件易于改變，并能得到嚴格的控制，有利于單因子分析。二是細胞培養便于我們對細胞生長、發育過程的觀察，可以用顯微鏡直接觀察亦可應用顯微縮時電影技術記錄其進程。因而，細胞培養是探索和解釋細胞生命活動規律的一種簡而易行的技術。
然而，細胞培養方法也有其局限性，由于培養的細胞生活在脫離了機體的復雜的環境條件下，其生態環境和細胞之間的相互關系都改變了，因此，其細胞生物學性質必然也會發生某些改變。所以在人工培養條件下觀察到的結果難于正確反映細胞或組織在機體內部的狀況。這一點是我們在應用此技術進行研究時應該注意的。
盡管如此，由于細胞培養技術的優點是其他實驗方法和技術所不能比擬的，所以近年來，細胞培養技術在分子生物學、遺傳學、老年學、免疫學、腫瘤學和病毒學等很多領域都得到了廣泛的應用，并取得了很多重大的成果。
細胞培養是一種程序復雜而又要求十分嚴謹的實驗技術。要使細胞在體外長期生存，必須模擬體內環境，共給細胞存活所必需的條件。如供給適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖以及有關的生長因子；氧氣及適宜的溫度；注意調節其外環境的酸堿度（pH）與滲透壓；以及為排除細胞代謝產物的危害，保持良好適宜的外環境而進行必需的傳代等等。所有這一切條件與操作都要保持在無菌條件下進行。

一、目的與要求
通過本實驗了解原代細胞與傳代細胞培養的基本方法以及在細胞培養過程中嚴格的操作程序。
初步掌握無菌操作的基本原則，認識無菌操作在細胞培養中的重要性。

二、實驗內容
1、原代細胞的制作——示范
2、傳代細胞的傳代

三、實驗步驟
（一）原代細胞的制作——以乳鼠腎細胞原代單層靜置培養為例，按實驗時操作的順序進行描述。
1.操作者首*行手的清洗與消毒，再將實驗用品放在合適的位置，然后配置營養液及調節平衡鹽液的pH值。
2. 配液
（1）乳鼠腎細胞營養液的配置：
0．5％LH 液 90％
犢牛血清 10%
1萬單位/ml青、* 加至約100單位/ml
7.4%NaHCO3 調pH至6.8~7.0
（2）平衡鹽液－Hank液的調節：
用7.4％NaHCO3調Hank液的pH至6.8~7.0
（3） 調*的pH值
25%*溶液中加入數滴NaHCO3,充分混勻,使其pH值為6.8~7.0。
3 .處死動物
在動物細胞培養中，為避免過多血細胞的干擾，一般采用剪斷動物頸動脈放血的方法處死動物，然后用水浸濕體表的被毛（或用新潔爾滅溶液）。將動物固定在解剖板上，使其背部向上，先用碘酒棉球消毒背部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦過的部位。
4.取腎
在腰部的后緣，用解剖剪提起皮膚，剪開皮膚，將剪開的皮膚分別拉向兩邊。此時，再換一把解剖剪及解剖鑷，剪開背部的肌肉，暴露出腹腔，即可見到腎臟（一般右腎略低于左腎），用彎頭*取出腎臟，置于無菌培養皿中。
5.剪腎
用眼科剪及鑷，將腎膜剪破，并將其剝向腎門，去腎膜及脂肪。再用Hank液洗滌一次，再將洗過的腎臟轉入另一培養皿中。另換一把眼科剪及鑷，沿腎臟的縱軸剪開，去掉腎盂部分，將腎剪成數塊，然后用Hank液洗滌一次。將洗過的腎塊轉移入無菌的*瓶（或小燒杯）中。用彎頭眼科剪，將腎剪成1立方毫米大小的塊，組織塊的大小應盡量均勻一致，再用Hank液洗滌2～3次，直到液體澄清為止。
6.消化及分散組織塊
將上步清洗過的Hank液吸掉，按組織塊體積的5～6倍量加入0.25%*液（pH為7.6~7.8）。置于37℃水浴中進行消化。消化時間在20～40分鐘左右（消化時間的長短與多種因素有關，如蛋白酶的活性及濃度，不同動物及年齡，組織塊的大小等等）。每隔10分鐘搖動一次*瓶，以便組織塊散開，以利于繼續消化，直到組織變成松散、粘稠狀，并且顏色略變為白色為止。這時可從水浴中取出*瓶，吸去*液，再用 Hank洗滌2～3次。然后，加入少量乳漢液，用吸管反復吹打組織塊，直到大部組織塊均勻分散成混淆的細胞懸液為止。此時，可將分散的細胞懸液經過滅菌的紗布（或不銹鋼網）進行過濾，以除去部分較大的組織碎片。