甘油含量檢測試劑盒說明書

【資料簡介】

甘油含量檢測試劑盒說明書

 

描述：甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。脂蛋白酯酶能水解血液中的甘油三酯；胰脂酶可以水解食 物中的甘油三酯；激素敏感脂肪分解酶能水解脂肪細胞中的甘油三酯。與游離脂肪酸一樣，甘 油含量是甘油三酯水解反應的可靠檢測指標，但檢測更方便。本試劑盒采用甘油氧化酶法 和經(jīng)典 GPO-Trinder 酶學反應相結(jié)合的方法，通過比色法測定液體樣本中的甘油含量。經(jīng)過優(yōu) 化后，操作步驟更加簡單，檢測線性范圍在 10-1200µmol/L，可靠性和重復性俱佳，適合生物 醫(yī)學、食品實驗室檢測。

參考文獻：

1.Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.

2.Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145

原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過氧 化氫；在過氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。

適用范圍：測定血液、細胞培養(yǎng)基、體液、酒類飲料中的甘油濃度。

組成 ：

R1 試劑 20 ml R2 試劑 5 ml

4 mmol/L 甘油標準品 1 ml

4 ºC，儲存6 個月。

所需設(shè)備：酶標儀、生化分析儀或 721、722 型可見光分光光度計。佳工作波長 550nm，如 無此波長建議優(yōu)先選用 570nm、次選 530、490nm。

操作步驟：

一、樣本處理：

1、 酒類、飲品、清澈液體樣本：可直接進行測定，如超過線性范圍可用蒸餾水或生理鹽水稀釋后 再測定。

2、培養(yǎng)液：取不含酚紅、無顏色、無血清的細胞培養(yǎng)基，如有細胞碎片應 4ºC,，12,000g 離心 5min,取上清進行測定。

3、血液：新鮮抗凝血，4ºC，2,000g 離心 5min 得到血漿；非抗凝血，先 4ºC 靜置 2h 得到血清后， 2000g 離心 10min,除去血細胞。將得到的血漿/血清 70ºC 加熱 10 分鐘滅活內(nèi)源脂肪酶，12,000g 離心 10min ,取上清測定或-20ºC 保存。

二 、工作溶液配制：按 4:1 比例，取 4 ml 試劑 R1 與 1 ml 試劑 R2 混合，立即使用或 4ºC 保存

<1 天，變色棄去。

三 、標準品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，將 4 mM 甘油標準品倍比稀 釋為 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L，通常取其中 4~6 管即可， 注意設(shè)置 0 濃度對照反應管。

四、 甘油濃度測定： 

1、參見下表進行加樣。為使反應時間盡量一致，減小實驗誤差，可先加入標準品、待測樣品，然后再加入工作溶液。（注意：當甘油濃度較低時，可將待測樣品與工作溶液按照 100µl:100µl體積混合，然后再進行測定，但是如果樣品體積超過100µl時將會稀釋工作液中酶的濃度，使反應靈敏度下降。如果待測樣品濃度超過線性范圍，可進行適當稀釋，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)來計算樣品中甘油濃度。）

2、37ºC 或 25ºC 反應 15 分鐘。反應平衡后顏色在 60 分鐘定。 3、先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零，然后測定各管 OD 值。

4、繪制標準曲線并計算甘油濃度。

附 Excel 作圖步驟：各標準管 OD 值為 y 軸，標準品濃度為 x 軸。(1)鼠標左鍵圈住數(shù)據(jù)，點擊做圖向?qū)Вx擇-散點圖-，點擊-完成-。(2)鼠標右鍵點圖上的某一點，點擊-添加趨勢線-，點擊-選項-，點擊-顯示公式-和-R2 值-。

 

表一：

酶標微板測定的加樣比例（檢測范圍  10-1200µmol/L）

（可對樣品和工作液比例進行微量調(diào)整）

	低濃度甘油樣品測 定			高濃度甘油樣品測定
	空白管	標準品	樣本管	空白管	標準品	樣本管
蒸餾水µl	50			5
標準品µl		50			5
樣品µl			50			5
工作液µl	150	150	150	195	195	195

 

 

表二：

1 ml 比色杯測定的加樣比例（檢測范圍 10-1200µmol/L）

	低濃度甘油樣品測 定			高濃度甘油樣品測定
	空白管	標準品	樣本管	空白管	標準品	樣本管
蒸餾水µl	200			50
標準品µl		200			50
樣品µl			200			50
工作液µl	600	600	600	750	750	750

 

說明：

1、維生素  C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度  EDTA干擾測試。

2、正常血清甘油濃度為20-130µmol/L，細胞培養(yǎng)時須用不含酚紅的無色無血清培養(yǎng)基，如果 培養(yǎng)基中含有酚紅，可以選擇含有酚紅的無細胞培養(yǎng)基作為對照進行測定。