PCR法DNA探針標記試劑盒使用說明書

【資料簡介】

 PCR法DNA探針標記試劑盒

PCR DNA Probe Labeling Kit

原理及特點PCR標記的原理是用帶標記的dNTP進行PCR，zui后得到的PCR產物將帶有標記，可以直接用于雜交試驗。其原理示意圖如下：

PCR法制備DNA探針示意圖

 

本產品在上述原理的基礎上本產品的特點是：

1.一站式，不需要自己單獨準備標記的核苷酸。

2.可用于各種同位素標記和其他任何非同位素標記（90604A，但需自備標記底物，底物包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP）、其中90604B和90604C可直接用于*和地高辛標記，不需自備標記底物。

3.本試劑盒提供的dNTP中，標記和非標記dNTP的比例經過優化，不需要自己摸索。本產品得到的探針參入率一般為4-5%（每100個核苷酸中有4-5個將帶有非同位素標記）。

4.如果使用非同位素標記，得到的DNA探針將非常穩定，可低溫長期放置。

5.可以用于Southern 和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等分析。

規格及成分成份5次塑料袋包裝

PCR Buffer 10×

（含15 mM MgCl2）50 uL

Taq DNA 聚合酶（5U/uL）25 uL

MgCl2（25 mM）50 uL

dATP、dTTP、dTP、dGTP各5 uL,共四管

標記dNTP（含Biotin-11-dUTP）5 uL （B和C型有）

對照引物混合物（10 uM）10 uL

對照模板DNA5 uL

超純水1 mL

使用手冊1份

注：A型用于同位素標記或自選標記，四種dNTP每種5 uL，分開提供，每種濃度為2 mM；B型提供含Biotin-11-dUTP的dNTP混合物，用于*標記；C型提供含DIG-dUTP的dNTP混合物，用于地高辛標記。

 

運輸及保存低溫運輸，-20℃保存，有效期一年

自備試劑DNA模板和模板專一性引物。

使用方法一：優化PCR條件

1.設計引物時，使PCR產物的長度在300-2000 bp之間。過短則標記參入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。

2.由于用戶的探針各不相同，所以需要用戶先自行優化PCR條件，不能有非特異擴增，因為標記的非特異擴增產物會引起雜交后檢測時的高背景甚至假陽性。一旦優化，請不要更改PCR參數和任何成分（用哪個批次做優化實驗，就用同一批次做標記實驗）。本試劑盒提供的Taq DNA聚合酶和PCR Buffer、MgCl2足夠45次10 uL的優化反應和5次10 uL的標記反應用，但優化用的dNTP需要自備。

3.雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈，但雜交時它們彼此還會復性，與探針與靶片段的結合反應相競爭，降低檢測效率。因此為進一步提高探針檢測靈敏度，用于單基因檢測等試驗，強烈建議通過控制兩條引物的比例來實現單鏈PCR，制備高靈敏度的單鏈DNA探針。單鏈PCR條件也需要優化，一旦優化，請不要更改PCR參數和任何成分（用哪個批次做優化實驗，就用同一批次做標記實驗）。

4.回收非標記PCR產物作為電泳對照。

二：探針標記及電泳檢測

1.按下表設置一個10 uL的標記反應體系。

成份用量

PCR Buffer, 10×1 uL

標記dNTP（見注）1 uL

模板專一性引物一（自備）1 uL（10 uM）

模板專一性引物二（自備）1 uL（10 uM）

模板DNA（自備、總量不超過1 ug）1 uL

Taq DNA聚合酶（5U/uL）1 uL

超純水補到10 uL

2.用*步優化的PCR參數進行標記PCR。

3.取標記反應產物1 uL，在瓊脂糖凝膠上電泳,用回收的非標記PCR產物（同樣的引物和模板擴增得到，只是沒標記）。由于標記反應的PCR產物中有非同位素的參入、因此泳動速度將慢于非標記PCR產物（但同位素標記不能用此法）。下圖是一個典型的電泳結果圖：

 

標記的DNA（右）與未標記的DNA（左）電泳比較

4.剩余的標記產物可以不經過純化，直接加熱變性后加入（對雙鏈探針）或直接加入（對單鏈探針）雜交液中使用或者放-20℃長期保存。

5.如果要準確檢測標記效率（一般不必），取標記產物1μL和DIG標記的對照DNA（另售），用DNA稀釋液（另售）按10倍系列稀釋后點樣于帶正電荷尼龍膜上。用紫外交聯儀或真空烘烤固定DNA探針，按DIG雜交檢測試劑盒的方法進行信號檢測，然后與膜條上的DIG標記的對照DNA信號強度對比，推算出標記的探針濃度。如初始模板量較大，可取1 μL標記產物稀釋10~100倍后定。

6.如果有必要，可以用本試劑盒提供的對照模板和對照引物做按下表做對照標記PCR反應，所得產物長度為3000 bp：

程序名稱參數

預變性94℃ 4min 

PCR

（30個循環）94℃ 1 min

55℃ 1 min

72℃ 3 min

延伸72℃ 5 min

 

關聯產品隨機引物法DNA探針標記試劑盒（CAT#：90603）