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內質網(wǎng)Aβ相關結合蛋白抗體,Anti-ERAB

2012年12月23日 15:41:38人氣:276來源:上海安研商貿有限公司

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【資料簡介】

內質網(wǎng)Aβ相關結合蛋白抗體,Anti-ERAB

從免疫血清純化抗體

1. 剪取一小條0.45 μm 的硝酸纖維膜,置于1.5ml eppendorf 管中,浸沒于1 ml
1 mg/ml 的抗原溶液中,5 min。
2. 取出膜,置于濾紙上干燥。
3. 將膜放置于裝有1 ml Buffer A 的eppendorf 管,輕輕震蕩混勻30 min。
4. 移去Buffer A,用新鮮的Buffer A 洗一次,將膜浸沒于0.8-1 ml 相應的抗血
清中,1-2 h, 于混勻器上輕輕震蕩混勻。
5. 移去血清,用PBS 洗膜,4 次,每次5 min。
6. 洗脫抗體
新配置100 mM *(pH 2.5)抗體洗脫液,將膜置于洗液中,手輕搖
混勻2 min,迅速將洗液轉移至裝有100 μl 1 M Tris(pH 8.0)中和,使抗體
復性。第1 次洗脫用400 μl 抗體洗脫液,第2,3 次用200 μl。
7. 往洗脫下來的液體中加入100 μl Buffer A 以穩(wěn)定抗體,并分裝成30 μl 每管,
于-20℃保存。
注:所有步驟均在室溫完成。

內質網(wǎng)Aβ相關結合蛋白抗體,Anti-ERAB

精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用綜合技術,避免蛋白變性。如分離IgG時,多結合使 
用鹽析法與離子交換法,以求純化。提取IgM的方法也很多,如應用凝膠過濾與制備電泳法,或離子交換與凝膠過濾等。

一、鹽析法
取x ml血清加x ml生理鹽水,于攪拌下逐滴加入2xml飽和硫酸銨,硫酸銨的終飽和度為50%。
↓4℃,3h以上,使其充分沉淀離心(3000rpm),20min,充上清,以xml生理鹽水溶解沉淀,再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。
↓置4℃3h以上,[此時,(NH4)2SO4的飽和度為33%]重復上述第二步過程1~2次。末次離心后所得沉淀物為γ-球蛋白,以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml裝入透析袋。
↓對PBS充分透析、換液3次,至萘氏試劑測透析外液無黃色,即無NH4+為止。
取透析袋內樣品少許作適當倍數(shù)稀釋后,以751型紫外分光光度計測定蛋白含量。
影響鹽析的因素很多,如蛋白質的濃度,鹽的濃度,飽和度和pH,溫度等都可影響鹽析的結果,操作時要充分注意(參閱本章 第二節(jié) )。
二、冷酒精沉淀法
分離過程如下。血清加3倍體積的蒸餾水,調節(jié) pH至7.7(±)冷卻到0℃。在激烈攪拌的條件下,加預冷的酒精(-20℃)到zui終濃度為20%,保持在-5℃。產(chǎn)生的沉淀(A),含有大多數(shù)種類的免疫球蛋白。沉淀A懸浮于25倍體積的0.15~20mol/L NaCl溶液(冷)中,加有0.05mol/L醋酸調節(jié) pH到5.1,產(chǎn)生的沉淀(B),包括大部分的IgA和IgM,IgG留在上清液內。調節(jié) 上清液的pH到7.4,加冷酒精(-20℃~-30℃)到zui終濃度為25%,維持在-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%~98%IgG。不同動物,IgG分離的條件和產(chǎn)量略有不同。見表2-5。從沉淀(B)可按下述方法進一步分離出IgA和IgM的混合物:將沉淀(B)懸浮在0℃ 水中,調節(jié) pH到5.1,離心去除不溶的蛋白。調節(jié) 上清液離子強度到0.01~0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到zui終濃度為10%,保持在–2℃或-3℃低溫,所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。
表2-5 從幾種動物和人血清沉淀A分離IgM的條件
物 種   pH   沉淀條件   IgG產(chǎn)量
    酒精濃度(%)   離子強度   
人   5.1   15.   0.01   65
山羊   5.2   0   0.01   65
家兔   5.2   10   0.01   70
大鼠   5.0   15   0.01   50
豚鼠   5.1   15   0.01   70
三、DEAE-Sephadex A-50 柱層析純化免疫球蛋白
原理:DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝膠A-50)為弱堿性陽離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉變?yōu)镺H-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白(等電點為pH6.85~7.5),其余均屬酸性蛋白。PH7.2~7.4的環(huán)境中,酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通過柱層析,γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG.

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